痛瀉要方破壁飲片對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腸推進(jìn)及血管活性腸肽含量的影響*

胡 瑩，鄭依玲，梅全喜，彭偉文，宋 葉

（1.廣東省中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400；2.廣東省廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800；3.廣東省深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518101）

腸易激綜合征（IBS）為功能性腸道疾病[1]，臨床表 現(xiàn)為腹脹、腹瀉、腹痛及排便習(xí)慣改變等癥狀，臨床分型有便秘型（IBS-C）、腹瀉型（IBS-D）、混合型（IBS-M）及不定型（IBS-U），我國(guó)以 IBS-D發(fā)病率最高[2]。IBS-D的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與腸動(dòng)力異常、內(nèi)臟敏感、腸道通透性增加及“腦腸軸”功能失調(diào)等因素相關(guān)[3]?，F(xiàn)代療法常以脫敏、解痙為主，治療過(guò)程較長(zhǎng)，需長(zhǎng)期服藥，停藥后易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。痛瀉要方出自《丹溪心法》[4]，由炒白術(shù)、炒白芍、炒陳皮和防風(fēng)4味中藥組方，為治療脾虛泄瀉的傳統(tǒng)方劑，臨床常用于治療IBS-D，療效良好[5]。本研究中探討了痛瀉要方破壁飲片的藥效作用，為臨床應(yīng)用破壁中藥飲片提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：MultisKan FC型酶標(biāo)儀、洗板機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海橫平儀器儀表廠）；JY 92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為65 W，頻率為20～25 kHz）；超微粉碎勻漿機(jī)（德國(guó)Fluko公司）；TD25-WS型48孔多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TS-8型搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）；自動(dòng)程控烘箱（杭州卓馳儀器有限公司）。

試藥：痛瀉要方破壁飲片（中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20160130）；匹維溴銨片（商品名得舒特，法國(guó) Abbott Healthcare SAS公司，批號(hào)為642647）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)為78100150），RIPA裂解液（強(qiáng)）（批號(hào)為74k00153），均來(lái)源于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Rat血管活性腸肽（VIP）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）KIT 96T試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)為05/2017）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號(hào)為161115）。

動(dòng)物：SPF級(jí) SD大鼠 94 只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于山東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）20140007，飼養(yǎng)于廣東省中山市中醫(yī)院屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2015-0109。實(shí)驗(yàn)室 12 h晝夜交替，室內(nèi)恒溫（22±2）℃，相對(duì)濕度40% ～70%，統(tǒng)一適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 方法

藥液制備：稱取適量痛瀉要方破壁飲片，用90℃水充分溶解，混勻，配制成痛瀉要方破壁飲片低、中、高劑量溶液，濃度分別為 1.015g/kg（臨床 1/4 量）、2.030 g/kg（臨床 1/2 量）、4.060 g/kg（臨床 1 倍量），放涼，置 4 ℃冰箱保存，待用。取匹維溴銨片碾碎，用蒸餾水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.018 g/kg的陽(yáng)性對(duì)照藥液，置4℃冰箱保存，待用。

IBS-D動(dòng)物模型建立：采用改良慢性束縛刺激法[6]建立IBS-D動(dòng)物模型。隨機(jī)挑選8只SD大鼠作為正常組，其余大鼠全部參與造模。造模大鼠每日于固定時(shí)間捆綁束縛3 h，再隨機(jī)選擇另一種復(fù)合刺激方式補(bǔ)充刺激。復(fù)合刺激方式包括晝夜顛倒12 h/12 h，禁食24 h，強(qiáng)迫游泳 30 min，禁飲 24 h，懸尾 1 h，孤養(yǎng) 12 h，飲糖水24 h。每種方法隨機(jī)重復(fù)2～3次，大鼠連續(xù)刺激造模21 d，造模期間觀察大鼠的體質(zhì)量、行為活動(dòng)、飲食飲水等變化。

動(dòng)物分組及給藥：將造模大鼠隨機(jī)分為6組，分別為模型組，匹維溴銨組，痛瀉要方破壁飲片低、中、高劑量組。各組大鼠于造模后第7天開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)21 d，每天1次，正常組及模型組灌胃等體積蒸餾水。

樣本采集：試驗(yàn)結(jié)束前1 d，所有動(dòng)物均禁食不禁飲18 h，并于末次灌胃給藥后將大鼠置代謝籠內(nèi)1 h收集糞便，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉大鼠，待翻正反射消失后迅速打開(kāi)腹腔采集腹主動(dòng)脈血；同時(shí)取出大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織并分為2段，分別置液氮及4%多聚甲醛中儲(chǔ)存；最后打開(kāi)大鼠頭骨，取出大腦組織，將其分為2份，分別置液氮及4%多聚甲醛儲(chǔ)存。將液氮中的結(jié)腸組織、腦組織標(biāo)本隨后移入-80℃冰箱中保存。

1.3 觀察指標(biāo)

體質(zhì)量：造模期間注意觀察動(dòng)物的狀態(tài)、毛色及飲食飲水狀態(tài)，并記錄試驗(yàn)期間大鼠第 1，7，14，21，28天體質(zhì)量變化情況。

排便情況：觀察大鼠第 1，7，14，21，28 天的排便情況，于代謝籠中收集大便，按照Bristol評(píng)分系統(tǒng)[7]評(píng)估，并記錄大鼠排便粒數(shù)。詳見(jiàn)表1。

表1 Bristol大便分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Bristol classification and scoring criteria

小腸推進(jìn)率：大鼠末次灌胃給藥后1 h，每只大鼠灌胃自制營(yíng)養(yǎng)糊（活性炭與奶粉比例為1∶5，m/m）2 mL，待腸蠕動(dòng)30 min后將大鼠依據(jù)灌胃營(yíng)養(yǎng)糊先后順序處死，取出小腸，用直尺測(cè)量小腸全長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)糊推進(jìn)長(zhǎng)度，并計(jì)算小腸推進(jìn)率，小腸推進(jìn)率（%）=（推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸全長(zhǎng)）×100%。

血清、結(jié)腸及腦組織中VIP含量（ELISA法）：血漿于4℃條件下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒步驟測(cè)定血清中VIP含量。將結(jié)腸組織從-80℃冰箱中取出，室溫解凍，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈，濾紙吸干多余液體，用眼科剪剪碎，并加入裂解液，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎10 s，再用手持式超微粉碎勻漿儀進(jìn)一步粉碎（以上步驟均在冰浴條件下完成），勻漿液于12 000 r/min離心20 min，取勻漿上清液進(jìn)行蛋白定量，并按ELISA試劑盒步驟測(cè)定VIP含量。將腦組織從-80℃冰箱中取出，于室溫解凍，取出腦組織，勻漿制作及測(cè)定步驟與結(jié)腸組織相同。

結(jié)腸、大腦組織形態(tài)學(xué)：將取出的大鼠結(jié)腸組織及腦組織放入10%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化

與正常組比較，模型組大鼠造模后體質(zhì)量下降明顯，第 7天體質(zhì)量最低（P ＜0.05），第 14，21，28 天體質(zhì)量緩慢回升，但仍處于較低水平（P＜0.05）。與模型組比較，第7天，各給藥組大鼠體質(zhì)量均上升，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第21，28天，各給藥組大鼠體質(zhì)量回升明顯（P＜0.05），破壁飲片高劑量組效果較好，結(jié)果與匹維溴銨組最接近。詳見(jiàn)表2。

2.2 排便情況

與正常組比較，模型組大鼠糞便Bristol評(píng)分顯著升高（P＜0.05），造模后大鼠大便性狀改變明顯，形狀不規(guī)則多呈糊狀，或排稀便、水便。與模型組比較，造模第7天各給藥組大鼠Bristol評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模第14，21，28天各給藥組大鼠隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，大便性狀逐漸改善，糞便Bristol評(píng)分逐漸回落，各給藥組評(píng)分第28天最低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

與正常組比較，模型組大鼠排便數(shù)量于造模后第7天急劇升高（P ＜0.05），第 14，21，28天均維持在較高數(shù)量（P＜0.05）。與模型組比較，破壁飲片各劑量組大鼠造模第7天排便數(shù)量均大幅度增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各給藥組第14，21，28天排便粒數(shù)逐漸減少（P＜0.05），第28天各組大鼠排便數(shù)量最少，其中破壁飲片高劑量組效果與匹維溴銨組接近，呈濃度依賴性。詳見(jiàn)表4。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g，n=8）Tab.2 Comparison of body mass of rats in each group（±s，g，n=8）

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g，n=8）Tab.2 Comparison of body mass of rats in each group（±s，g，n=8）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.05。下表同。Note：Compared with those in the model group，*P ＜ 0.05；compared with those in the normal group，#P ＜ 0.05；as well as the following tables.

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06第1天236.00±2.83 237.60±3.66 240.73±4.76 237.78±3.88 233.69±5.21 233.33±3.30第7天239.25±5.34*216.40±2.55#219.09±6.20 217.80±3.79 218.22±5.89 216.73±4.90第14天252.13±4.61 220.40±8.50#235.82±4.94*227.30±7.32 223.89±5.46 230.00±4.56*第21天261.88±3.13 225.00±3.89#245.27±5.18*238.20±7.69*236.33±5.15*242.73±4.98*第28天277.13±3.27 227.80±3.94#250.55±5.16*243.10±4.51*241.22±4.66*248.36±3.98*

表3 各組大鼠糞便Bristol評(píng)分比較（±s，分，n=8）Tab.3 Comparison of Bristol scores in feces of rats in each group（±s，point，n=8）

表3 各組大鼠糞便Bristol評(píng)分比較（±s，分，n=8）Tab.3 Comparison of Bristol scores in feces of rats in each group（±s，point，n=8）

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06第1天3.33±0.50 3.30±0.48 3.50±0.52 3.40±0.52 3.45±0.52 3.42±0.52第7天3.33±0.50 5.00±0.67#4.67±0.78 4.90±0.88 5.18±0.75 4.92±0.79第14天3.33±0.50 6.10±0.74#4.75±0.75*5.50±0.53 5.27±0.47*5.00±0.60*第21天3.33±0.50*6.50±0.53#4.67±0.65*5.30±0.48*5.18±0.40*4.92±0.51*第28天3.33±0.50*6.70±0.48#4.42±0.67*4.90±0.74*4.82±0.60*4.67±0.65*

表4 各組大鼠排便粒數(shù)比較（±s，粒，n=8）Tab.4 Comparison of fecal pellets of rats in each group（±s，pellet，n=8）

表4 各組大鼠排便粒數(shù)比較（±s，粒，n=8）Tab.4 Comparison of fecal pellets of rats in each group（±s，pellet，n=8）

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06第1天9.88±2.36 9.10±2.02 8.42±2.02 8.50±2.17 8.55±1.97 9.67±2.39第7天9.50±1.85*33.30±3.34#31.67±2.77 34.30±2.50 33.36±2.29 32.25±2.22第14天9.50±1.60*38.90±1.91#26.83±2.21*30.20±2.78*30.64±1.80*29.92±3.18*第21天9.25±1.67*41.70±2.31#23.92±2.35*27.10±3.48*25.36±3.35*26.58±3.11*第28天9.38±1.60*41.60±3.20#18.92±2.54*24.00±2.26*22.73±1.68*21.17±2.72*

2.3 小腸推進(jìn)率

與正常組比較，模型組大鼠小腸推進(jìn)長(zhǎng)度明顯延長(zhǎng)，小腸推進(jìn)率大幅度提高（P＜0.05）。與模型組比較，破壁飲片各劑量組大鼠小腸推進(jìn)長(zhǎng)度縮短，小腸推進(jìn)率下降（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表 5。

表5 各組大鼠小腸推進(jìn)率比較（±s，n=8）Tab.5 Comparison of small intestinal propulsion rate in each group（±s，n=8）

表5 各組大鼠小腸推進(jìn)率比較（±s，n=8）Tab.5 Comparison of small intestinal propulsion rate in each group（±s，n=8）

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06小腸長(zhǎng)度（cm）105.88±6.58 103.75±4.65 106.50±5.21 103.38±5.73 102.88±4.85 102.50±5.01推進(jìn)長(zhǎng)度（cm）57.13±5.17*82.38±3.54#61.63±6.97*77.13±4.16 75.13±6.38 69.00±6.00*小腸推進(jìn)率（%）53.96±3.71*79.43±2.17#57.75±4.46*74.75±4.96 73.05±5.53*67.28±4.27*

2.4 血清、結(jié)腸及腦組織中VIP含量

與正常組比較，模型組大鼠血清、結(jié)腸及下丘腦VIP含量顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，破壁飲片各劑量組大鼠血清、結(jié)腸及下丘腦中VIP含量顯著上升（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表 6。

表6 各組大鼠血清、結(jié)腸及下丘腦VIP水平比較（±s，pg/mL，n=8）Tab.6 Comparison of VIP level in serum，colon and hypothalamus of rats（±s，pg/mL，n=8）

表6 各組大鼠血清、結(jié)腸及下丘腦VIP水平比較（±s，pg/mL，n=8）Tab.6 Comparison of VIP level in serum，colon and hypothalamus of rats（±s，pg/mL，n=8）

組別 劑量（g/kg）VIP正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組0.018 1.015 2.03 4.06血清153.79±40.26*84.59±10.16#143.75±17.09*103.44±16.49 144.96±18.08*143.94±20.61*結(jié)腸241.40±21.81*118.13±24.07#220.21±23.18*151.06±30.63 177.62±23.24*208.29±17.41*腦組織248.57±18.67*139.32±13.34#221.38±9.35*135.41±12.07 181.22±14.57*207.81±15.35*

2.5 結(jié)腸、大腦組織形態(tài)學(xué)

結(jié)腸病理切片結(jié)果：正常組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則整齊，上皮細(xì)胞未見(jiàn)壞死脫落，黏膜層未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，固有層腺體未見(jiàn)萎縮減少，黏膜下層血管未見(jiàn)充血水腫，肌層未見(jiàn)萎縮溶解性改變。與正常組比較，模型組大鼠腸黏膜層上皮細(xì)胞有壞死脫落，黏膜結(jié)構(gòu)輕微破壞，固有層中可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體未見(jiàn)明顯萎縮，黏膜下層和肌層未見(jiàn)明顯病理改變。與模型組比較，破壁飲片低、中、高劑量組大鼠的腸黏膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則整齊，未見(jiàn)壞死脫落細(xì)胞及明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，固有層中腺體未見(jiàn)萎縮及減少，黏膜下層及肌層未見(jiàn)明顯病理改變；匹維溴銨組除腸黏膜可見(jiàn)個(gè)別上皮細(xì)胞壞死脫落，其余均未見(jiàn)明顯病理改變。詳見(jiàn)圖1。

大腦病理切片結(jié)果：正常組大鼠海馬細(xì)胞排列密集，中樞神經(jīng)纖維未見(jiàn)扭曲及萎縮性改變。與正常組比較，模型組大鼠海馬顆粒層神經(jīng)元細(xì)胞核發(fā)生明顯固縮，神經(jīng)纖維變得短粗、扭曲。與模型組比較，破壁飲片低、中劑量組大鼠腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生固縮，細(xì)胞層數(shù)減少、稀疏，神經(jīng)纖維短粗、扭曲，稀疏變淡；而破壁飲片高劑量組大鼠海馬顆粒層神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，未見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞核發(fā)生固縮，神經(jīng)纖維排列密集未見(jiàn)扭曲、萎縮等改變。詳見(jiàn)圖2。

3 討論

IBS是一種反復(fù)發(fā)作、腸道功能紊亂的慢性疾病[1]，病程綿延反復(fù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。IBS-D屬中醫(yī)“泄瀉”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，人體內(nèi)肝主疏泄，善調(diào)氣機(jī)，喜條達(dá)而惡抑郁；脾主受納，善運(yùn)化水谷精微，如肝氣郁結(jié)而犯脾土，肝脾失調(diào)，則影響脾運(yùn)化水谷，脾運(yùn)失常導(dǎo)致消化不良，易出現(xiàn)腹脹、腹瀉、腹痛及情志失調(diào)、焦慮等癥狀，與IBS-D病機(jī)相似。痛瀉要方出自朱丹溪的《丹溪心法》[4]，乃治療肝郁脾虛痛瀉之良方，現(xiàn)代臨床常用于治療IBS-D[8]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，痛瀉要方破壁飲片各劑量組可有效控制IBS-D大鼠體質(zhì)量下降，通過(guò)減少大便次數(shù)及稀便情況緩解腹瀉癥狀，還可減慢腸蠕動(dòng)，降低腸道推進(jìn)率，同時(shí)刺激IBS-D大鼠腸道分泌VIP，抑制腸道運(yùn)動(dòng)過(guò)速。表明痛瀉要方破壁飲片對(duì)IBS-D有較好療效，其中破壁飲片高劑量組效果最好，優(yōu)于破壁飲片低、中劑量組。

A.正常組 B.模型組 C.匹維溴銨組 D.破壁飲片低劑量組 E.破壁飲片中劑量組 F.破壁飲片高劑量組圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理切片（HE，×10）A.Normal group B.Model group C.Pinaverium bromide group D.Low-dose ultrafine granular powder group E.Medium-dose ultrafine granular powder group F.High-dose ultrafine granular powder groupFig.1 Pathological sections of colonic tissues of rats in each group（HE staining，×10）

A.正常組 B.模型組 C.匹維溴銨組 D.破壁飲片低劑量組 E.破壁飲片中劑量組 F.破壁飲片高劑量組圖2 各組大鼠腦組織病理切片（HE，×10）A.Normal group B.Model group C.Pinaverium bromide group D.Low-dose ultrafine granular powder group E.Medium-dose ultrafine granular powder group F.High-dose ultrafine granular powder groupFig.2 Pathological sections of brain tissues of rats in each group（HE staining，×10）

VIP是一種抑制性胃腸道調(diào)節(jié)激素[9]，具有舒張血管及松弛平滑肌的作用，可直接抑制胃腸道平滑肌的收縮，同時(shí)還可通過(guò)促進(jìn)一氧化氮（NO）與環(huán)磷酸腺苷（cAMP）合成，再次抑制胃腸平滑肌的運(yùn)動(dòng)，減慢胃腸道蠕動(dòng)，降低胃排空及腸推進(jìn)速度，提示大鼠腸道VIP分泌異常可能與IBS-D發(fā)病密切相關(guān)[10-11]。痛瀉要方破壁飲片可有效促進(jìn)IBS-D大鼠腸道分泌VIP，達(dá)到止瀉作用，故推測(cè)有效調(diào)節(jié)大鼠腸道VIP分泌可能是痛瀉要方破壁飲片治療IBS-D的作用機(jī)制之一。

研究表明，中藥飲片經(jīng)破壁技術(shù)處理后并不會(huì)破壞有效成分[12]。且前期研究發(fā)現(xiàn)，痛瀉要方中藥飲片與破壁飲片有效成分及含量一致[13-14]，說(shuō)明破壁飲片可發(fā)揮與傳統(tǒng)中藥飲片相同的藥效作用，同時(shí)具有給藥劑量準(zhǔn)確、獨(dú)立包裝、攜帶方便的優(yōu)勢(shì)，不需要煎煮，熱水沖服即可，對(duì)于不方便煎煮中藥或是不接受服用大劑量湯劑的患者更有優(yōu)勢(shì)。建議臨床可將破壁飲片作為傳統(tǒng)中藥飲片的補(bǔ)充品種，為進(jìn)一步應(yīng)用中醫(yī)藥服務(wù)廣大患者帶來(lái)便利。