二級(jí)出水中抗生素抗性基因存在形態(tài)及質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移影響因素

孫麗華, 朱珺瑤, 陽兵兵, 劉燁輝, 高 呈, 馮萃敏

(1.北京建筑大學(xué)城市雨水系統(tǒng)與水環(huán)境教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室， 北京 100044； 2.北京建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院， 北京 100044； 3.金融街控股股份有限公司， 北京 100032)

抗生素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和養(yǎng)殖領(lǐng)域，可以防治人類的傳染病，預(yù)防動(dòng)物疾病并促進(jìn)動(dòng)物生長[1]。然而人體或動(dòng)物并不能完全吸收進(jìn)入體內(nèi)的抗生素，導(dǎo)致大量的抗生素通過糞便進(jìn)入環(huán)境[2]，誘導(dǎo)和選擇出抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)[3]。近年來，在土壤、地表水、地下水、污水甚至飲用水中都檢出了大量的ARGs[4-5]。城市污水廠是人類生產(chǎn)生活產(chǎn)生抗生素的聚集地，近年來已在很多污水廠進(jìn)水中檢測到ARGs[6]。然而傳統(tǒng)污水處理系統(tǒng)雖可有效控制耗氧有機(jī)物、氨氮和總氮等污染物，但對(duì)ARGs的控制效果相對(duì)有限[7]，使得污水廠的二級(jí)出水中仍含有大量ARGs。

ARGs主要通過親代遺傳和水平轉(zhuǎn)移兩種途徑傳播。其中，水平轉(zhuǎn)移是ARGs傳播的重要方式，利用可移動(dòng)的遺傳因子，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等，通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式將ARGs從一種細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌中，從而使細(xì)菌獲得ARGs[8]。有研究表明[9]，大多數(shù)ARGs位于質(zhì)粒上，只有少部分位于染色體上，并且質(zhì)粒所具備的自我復(fù)制特性，使得接合轉(zhuǎn)移成為ARGs水平轉(zhuǎn)移中發(fā)生頻率最高、最主要的轉(zhuǎn)移方式。Lu等[10]研究了納米銀和Ag+對(duì)ARGs接合轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)環(huán)境中亞致死濃度下可以促進(jìn)ARGs的接合轉(zhuǎn)移。Zhang等[11]通過對(duì)特定菌株的探究，發(fā)現(xiàn)3種消毒劑在次抑制濃度下可促進(jìn)同種屬和不同種屬細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移。上述研究說明外界因素會(huì)影響ARGs的接合轉(zhuǎn)移，但環(huán)境因素對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的影響程度如何，中外尚未見報(bào)導(dǎo)。深入探究接合轉(zhuǎn)移的影響因素有助于提出緩解ARGs水平轉(zhuǎn)移的方案。

現(xiàn)主要對(duì)某典型污水廠二級(jí)出水中ARGs的相對(duì)分子質(zhì)量分布和主要存在形態(tài)進(jìn)行分析，并考察環(huán)境因素(接合時(shí)間、溫度、pH等)對(duì)抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選取北京市某污水廠二級(jí)出水為實(shí)驗(yàn)原水，水樣取回后迅速放于4 ℃冰箱中低溫存儲(chǔ)。膜分級(jí)實(shí)驗(yàn)采用進(jìn)口平板超濾膜(Millipore，USA)，材質(zhì)為再生纖維(RC)。ARGs接合實(shí)驗(yàn)采用上海生物工程有限責(zé)任公司的硫酸卡那霉素(KAN)、氯霉素(CHI)篩選雙抗(KAN+CHI)接合子。接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒為pHS-AVC-LW1144，由北京合生基因有限公司構(gòu)建，攜帶硫酸卡那霉素(KAN)抗性，對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行改造，添加紅色熒光蛋白(red fluorecent protein， RFP)元件，熒光波長為584 nm，將改造后的質(zhì)粒導(dǎo)入供體菌內(nèi)，成功表達(dá)后顯紅色。供菌體選用S17-1 lamp pir大腸桿菌；受體菌選用MG1655-chl大腸桿菌，屬于工程改造菌株系列(K12)，攜帶氯霉素(CHI)抗性；供菌體和受菌體均由北京合生基因有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膜分級(jí)實(shí)驗(yàn)

膜分級(jí)實(shí)驗(yàn)采用400 mL的Millipore小型平板膜超濾杯(model8400, Amicon Corp)對(duì)水樣進(jìn)行過濾，分級(jí)所用的膜截留相對(duì)分子質(zhì)量分別為100、30、10、3、1 kDa；ARGs含量采用ABI PRISM7900型號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)(ABI Co.，美國)進(jìn)行檢測；質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移現(xiàn)象采用型號(hào)為FV1000的激光共聚焦顯微鏡(Olympuus Co.，日本)進(jìn)行檢測。

1.2.2 水中ARGs存在形態(tài)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)過程中采用DNA溶解酶對(duì)水中游離態(tài)ARGs進(jìn)行消除，在500 mL水樣中加入1 mg DNA溶解酶顆粒，經(jīng)2 h恒溫(25 ℃)水浴振蕩，之后在80 ℃水中加熱10 min，水樣冷卻后用0.22 μm膜片截留水中物質(zhì)，進(jìn)行qPCR定量檢測，得到細(xì)胞態(tài)的ARGs濃度情況。水樣中游離態(tài)ARGs含量為ARGs總量與細(xì)胞態(tài)ARGs含量的差。

1.2.3 ARGs接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中將供體菌(S17-1 lamp pir)和受體菌(MG1655-chl)分別接種在含有卡那霉素和氯霉素的LB(Luria-Bertan)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)活化，然后進(jìn)行ARGs接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。

(1)將活化后供、受體菌液離心(2 000g)10 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌菌液，去除上清液，洗滌三次，最后用LB培養(yǎng)基重新懸浮菌種，并調(diào)整OD600=0.4(菌種濃度大致為108CFU/mL)。

(2)分別取2.5 mL供體菌、受體菌混合搖勻進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，在37 ℃ LRH-250型的恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司，中國)中靜置培養(yǎng)16 h。

(3)取混合菌液搖勻，以10倍梯度稀釋法將混合菌液涂布在含KAN+CHI雙抗性的LB瓊脂固體培養(yǎng)基上，然后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h。

(4)統(tǒng)計(jì)LB瓊脂培養(yǎng)基上紅斑菌種生長情況，并計(jì)算接合子數(shù)量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 二級(jí)出水中ARGs的相對(duì)分子質(zhì)量分布

研究ARGs相對(duì)分子質(zhì)量分布實(shí)驗(yàn)中，采用5種不同截留相對(duì)分子質(zhì)量(100、30、10、3、1 kDa)的超濾膜對(duì)水樣進(jìn)行依次截留，檢測膜片上的ARGs濃度[c(ARGs)]，得到不同相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間的ARGs絕對(duì)豐度，分析ARGs在各個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間范圍的濃度情況以及各區(qū)間的濃度百分比，為了能直觀地對(duì)比不同的ARGs濃度情況，將得出的結(jié)果以log值記，即各個(gè)ARGs的濃度數(shù)量級(jí)，結(jié)果如圖1與表1所示。

圖1 二級(jí)出水中ARGs在各相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間的濃度分布Fig.1 Concentration distribution of antibiotic resistance genes in molecular weight range of the secondary effluent of sewage treatment plant

表1 二級(jí)出水中ARGs在各相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間濃度百分比Table 1 Concentration percentage of antibiotic resistance genes in secondary effluent in each molecular weight range

如圖1所示，從原水中ARGs總量可知，截留的tetX、sulI與轉(zhuǎn)移元件Ⅰ類整合子(intI1)的濃度較高，其log值分別為7.11、7.70、7.81，tetA、tetC、tetG和sulⅡ的濃度log值為5.56～6.24，而16S rRNA的濃度log值達(dá)到9.36。結(jié)果表明，污水處理廠的二級(jí)出水中仍含有濃度較高的ARGs，這也表明了傳統(tǒng)的污水處理工藝無法有效去除污水中含有的ARGs[12]。同時(shí)，二級(jí)出水中還含有較高濃度的Ⅰ類整合子和細(xì)菌數(shù)量，有研究表明高濃度的Ⅰ類整合子和細(xì)菌數(shù)量會(huì)促進(jìn)水中ARGs的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[13-14]。

圖1和表1結(jié)果顯示，在10～30 kDa、3～10 kDa和1～3 kDa區(qū)間膜片上所截留的ARGs含量很低，表明ARGs在該區(qū)間分布較少；在30～100 kDa區(qū)間發(fā)現(xiàn)，tetA、tetC、tetG、sulI、sulⅡ、intI1和16S rRNA在此區(qū)間的濃度百分比分別為0.5%、3.6%、3.7%、1.2%、2.1%、0.8%和0.2%，而tetX占總量的36.0%，大于其他ARGs在這一區(qū)間的濃度比例，這是因?yàn)閠etX是編碼合成一個(gè)具有388個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量為46.7 kDa的蛋白[15]，在30～100 kDa區(qū)間；在大于100 kDa相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間ARGs的濃度較高，tetA、tetC、sulI、intI1和16S rRNA濃度占膜片上各ARGs總量的90%以上，tetG和sulⅡ在此區(qū)間的濃度百分比分別為85.3%與85.1%，tetX在此區(qū)間占56.5%，二級(jí)出水中的ARGs主要分布在大于100 kDa區(qū)間，由此說明ARGs的相對(duì)分子質(zhì)量大小主要分布在大于100 kDa范圍，且由于部分ARGs吸附在水中大分子有機(jī)物的表面，提高了膜片對(duì)ARGs截留作用[16]，所以在100 kDa膜片上截留的ARGs濃度高。

2.2 二級(jí)出水中細(xì)胞態(tài)和游離態(tài)ARGs濃度分布

實(shí)驗(yàn)采用DNA溶解酶對(duì)水中游離態(tài)ARGs進(jìn)行消除，確定二級(jí)出水中ARGs的存在形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 二級(jí)出水中細(xì)胞態(tài)與游離態(tài)ARGs濃度Fig.2 Concentration antibiotic resistance genes of cell-associated and cell-free

結(jié)果表明，水中細(xì)胞態(tài)和游離態(tài)tetA濃度差別不大，其log值分別為6.12和6.15；其他ARGs(tetG、tetC、tetX、sulI、sulⅡ)、intI1以及16S rRNA的濃度差異明顯，均呈現(xiàn)游離態(tài)多于細(xì)胞態(tài)的規(guī)律。這是由于細(xì)胞態(tài)ARGs主要存在于懸浮污泥中，經(jīng)生化深度處理后細(xì)胞破碎裂解，釋放游離的攜帶ARGs的DNA片段[17]，使得二級(jí)出水中游離態(tài)的ARGs含量更高。張明美[18]研究表明，游離態(tài)的ARGs較細(xì)胞態(tài)更加難以去除，并且還可在環(huán)境中持久存在。所以，控制二級(jí)出水中游離態(tài)ARGs是降低ARGs傳播與轉(zhuǎn)移的重要措施。

2.3 水環(huán)境中質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移過程及其影響因素

2.3.1 質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移現(xiàn)象

為探究ARGs水平轉(zhuǎn)移的過程，將攜帶卡那霉素(KAN)抗性的接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHS-AVC-LW1144添加紅色熒光RFP元件，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入到供體菌S17-1 lamp pir大腸桿菌內(nèi)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察活性大腸桿菌的情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 抗性質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移過程Fig.3 The process of conjugative of resistant plasmids between bacteria

圖3(a)中，呈紅色長條狀的為抗性質(zhì)粒在供體菌內(nèi)成功表達(dá)的S17-1 lamp pir大腸桿菌，未熒光標(biāo)記呈長條狀的為受體菌(MG1655)，圓形的為其他菌種或菌膠團(tuán)。從圖3(a)～圖3(c)可以看出，在第20分鐘時(shí)，呈紅色熒光的供體菌與受體大腸桿菌和其他菌種或菌膠團(tuán)接觸，第40分鐘時(shí)供體菌周圍的菌體散發(fā)出微弱的熒光，第60分鐘時(shí)更多的受體大腸桿菌和其他菌種呈紅色熒光。該過程證實(shí)，ARGs可以在同種屬或不同種屬細(xì)菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移。

2.3.2 接合時(shí)間對(duì)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了接合時(shí)間為4、8、16、24、48 h的工況，觀察接合質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移情況。準(zhǔn)備供體菌和受體菌的混合液15份，每個(gè)接合時(shí)間點(diǎn)設(shè)3份，并設(shè)置供體菌和受體菌的空白對(duì)照組；放置在25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中，在無光照的條件下進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)，在不同接合時(shí)間時(shí)，將相應(yīng)的樣品涂布于攜帶雙抗性(KAN+CHI)的固體LB培養(yǎng)基中篩選接合子，并統(tǒng)計(jì)接合子濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 接合時(shí)間對(duì)抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響Fig.4 Effect of conjugative time on conjugative transfer of resistance plasmid

由圖4可知，在4～48 h之內(nèi)，質(zhì)粒接合子濃度隨時(shí)間的增加而依次遞增，在第48小時(shí)時(shí)接合子濃度最大，均值為(2.150.31)104CFU/mL；在4、8、16、24 h接合子濃度分別為(3.900.33)102、(1.650.26)103、(2.951.57)103、(1.380.13)104CFU/mL，并且在第24小時(shí)時(shí)增長率達(dá)到最大為3.66%。根據(jù)細(xì)菌生長曲線可知兩種大腸桿菌混合接種到新的培養(yǎng)基環(huán)境時(shí)，細(xì)菌數(shù)量快速增長，增加了細(xì)菌之間的接觸頻率，并且細(xì)菌在此時(shí)的密度基本上達(dá)到最大，有利于質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移，增加了發(fā)生接合轉(zhuǎn)移的概率。

2.3.3 溫度對(duì)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

溫度會(huì)影響細(xì)菌的繁殖速率以及酶的活性，同樣溫度的變化對(duì)大腸桿菌生長速率和細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外源基因的表達(dá)也有著非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了低溫(4 ℃)、常溫(25 ℃)、高溫(50 ℃)3組實(shí)驗(yàn)工況，進(jìn)一步探究溫度對(duì)質(zhì)粒pHS-AVC-LW1144上的卡那霉素基因接合轉(zhuǎn)移的影響。取供體菌和受體菌的混合液9份，每個(gè)溫度工況設(shè)3份，并設(shè)置供體菌和受體菌的空白對(duì)照，靜置16 h后，統(tǒng)計(jì)接合子濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對(duì)抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響Fig.5 Effect of conjugative temperature on conjugative transfer of resistance plasmid

由圖5可知，溫度越高，接合子濃度越低。在低溫工況下(4 ℃)，質(zhì)粒的接合子濃度明顯大于常溫以及高溫工況下的接合子濃度；高溫工況下的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合子濃度最低，僅為(1.001.41)102CFU/mL；這是由于實(shí)驗(yàn)采用的大腸桿菌為耐低溫的孢子形態(tài)細(xì)菌，在低溫情況下仍然具備較強(qiáng)的活性[19]，并且在低溫條件下供體菌和受體菌更容易達(dá)到感受態(tài)狀態(tài)，更有助于發(fā)生質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移；而高溫環(huán)境下絕大部分細(xì)菌已經(jīng)失活，降低了質(zhì)粒中ARGs的表達(dá)。丁滿生等[20]研究溫度誘導(dǎo)對(duì)重組大腸桿菌質(zhì)?？截悢?shù)的影響時(shí)，在42 ℃條件下持續(xù)誘導(dǎo)之后發(fā)現(xiàn)，高溫環(huán)境對(duì)菌體造成代謝負(fù)荷的增加以及菌體活性的下降導(dǎo)致質(zhì)?？截悢?shù)整體下降。另外常溫情況下細(xì)菌生長曲線在3～4 h時(shí)達(dá)到較高的細(xì)胞密度(OD600約為0.6)，在這段時(shí)間得到的轉(zhuǎn)化率最高，但高轉(zhuǎn)化率的持續(xù)時(shí)間較短；而在低溫環(huán)境中，接種后24 h內(nèi)的轉(zhuǎn)化率都會(huì)維持在較高水平，從而導(dǎo)致了低溫工況下的接合子濃度高于常溫和高溫工況。

2.3.4 pH對(duì)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

為探究pH對(duì)細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的影響，實(shí)驗(yàn)中配置了pH分別為5、7、9的鹽酸緩沖鹽溶液，將這三種不同pH的鹽酸緩沖鹽溶液重新懸浮供體菌和受體菌混合液，每個(gè)pH工況的混合液設(shè)3份，并設(shè)置空白對(duì)照組，放置于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)16 h，統(tǒng)計(jì)接合子濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 pH對(duì)抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響Fig.6 Effect of conjugative pH on conjugative transfer of resistance plasmid

由圖6可知，接合子濃度隨pH升高而增大，并且在pH=9的堿性環(huán)境中，接合子濃度最大，為(1.360.45)104CFU/mL，分別為中性和酸性環(huán)境下接合子濃度的4.6倍和13倍。這是由于大腸桿菌MG1655更適于生存在偏堿性環(huán)境中，細(xì)菌的生長代謝速率高，一定程度上促進(jìn)了質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)[21]；在酸性環(huán)境中，菌株的活性較低，導(dǎo)致接合子濃度較低，轉(zhuǎn)移頻率也較低，僅為(1.60±0.42)×10-5。Müller[22]研究環(huán)境和代謝酸對(duì)大腸桿菌生長行為的影響中發(fā)現(xiàn)， pH較高的條件對(duì)所測的188種大腸桿菌的生長率具有顯著的促進(jìn)作用。張海容等[23]在研究大腸桿菌堿性磷酸酶的構(gòu)象變化中，得出堿性磷酸酶的熒光強(qiáng)度隨pH的增大而增強(qiáng)，促進(jìn)了人大腸桿菌的生長速率，一般認(rèn)為是酸性環(huán)境破壞了穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的靜電作用，導(dǎo)致細(xì)菌活性較低。

3 結(jié)論

(1)城市污水廠二級(jí)出水中的仍然存在較高濃度的ARGs，并且相對(duì)分子質(zhì)量大小主要分布在大于100 kDa范圍內(nèi)；二級(jí)出水中游離態(tài)ARGs濃度高于細(xì)胞態(tài)ARGs。

(2)抗性質(zhì)粒pHS-AVC-LW1144可在同種屬或跨種屬細(xì)菌間進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移；在0～48 h，抗性質(zhì)粒濃度呈現(xiàn)遞增趨勢，在第48 h濃度達(dá)到最大；低溫工況(4 ℃)下的接合子濃度遠(yuǎn)高于常溫(25 ℃)和高溫(50 ℃)工況，促進(jìn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的效果顯著；堿性(pH=9)條件對(duì)抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的促進(jìn)效果優(yōu)于酸性(pH=5)和中性(pH=7)條件，堿性條件更有利于抗性質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。