神經(jīng)生長因子對兔牙髓干細(xì)胞體外增殖、成骨分化影響的實驗研究

路曉淼，姜 晟，李孝亮，田瑞雪，劉姍姍，趙莉莉，張 凱

牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是外胚層來源的干細(xì)胞，具有較高的細(xì)胞活性及多向分化潛能，因其取材豐富、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)一直受到研究者的青睞。DPSCs可參與牙髓的修復(fù)與重建[1-2]，具有高增殖、自我更新的能力，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)下可以分化為脂肪組織、軟骨組織和神經(jīng)組織等，因其高增殖率、高克隆潛力、高礦化潛力和較低的免疫原性，目前被認(rèn)為是口腔醫(yī)學(xué)中骨組織工程的種子細(xì)胞[3-5]。

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)是目前醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較為廣泛的外源性調(diào)節(jié)因子，具有營養(yǎng)神經(jīng)和修復(fù)神經(jīng)損傷等方面的作用[6-7]，在傷害性感受器的功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。外源性NGF還可通過注射的方式補(bǔ)充內(nèi)源性NGF的含量，避免其凋亡，保護(hù)受損的神經(jīng)元[8]。本研究在前期的實驗研究中發(fā)現(xiàn)NGF可以在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為軟骨并促進(jìn)其向成骨方向分化，但 NGF對DPSCs 的影響機(jī)制尚不明確,且NGF聯(lián)合DPSCs用于種植體周圍是否能夠促進(jìn)種植體早期骨結(jié)合也尚未可知。因此，本研究旨在探討NGF對兔DPSCs的增殖活性及成骨分化的影響，分析NGF和DPSCs的聯(lián)合應(yīng)用對牙髓損傷的修復(fù)，以期為探索NGF和 DPSCs促進(jìn)骨生成提供一定的依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與儀器 選取健康的新西蘭兔3只，3～4周齡，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，雌雄不限(由東方集團(tuán)提供)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±2)℃、濕度(60±5)%，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2015-0005。新西蘭兔于蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。主要試劑：胎牛血清(FBS)(美國GIBCO公司)、DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)、0.25% EDTA胰蛋白酶消化液(北京Solarbio公司)、青霉素-鏈霉素混合液(美國Hyclone公司)、Ⅰ型膠原酶(北京Solarbio公司)。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)、離心機(jī)(上海盧湘儀)、倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué))、超凈臺(蘇州德匯)、移液槍(北京康林)。

1.2 兔DPSCs的培養(yǎng) 在局麻環(huán)境下拔除兔前牙及前磨牙，放入三倍雙抗液中浸泡30 min，在超凈臺中用0.1 mmol/L的PBS溶液沖洗3次，用無菌拔髓針拔出牙髓組織，剪去距根尖1mm左右組織，余下牙髓組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小塊狀，置于15 mL離心管中。在離心管中加入3 g/L Collagenase-1和4 g/L分解酶各1 mL，混勻后置入37 ℃水浴中消化50 min，觀察細(xì)胞的消化情況。通過細(xì)胞篩網(wǎng)(孔徑200目)篩揀出未通過的組織塊，用0.1 mmol/L的PBS溶液沖洗3次，加入培養(yǎng)液后，置入CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，3 d換液一次。

1.3 細(xì)胞傳代 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，瓶底的細(xì)胞鋪滿80%左右時，去除原培養(yǎng)液，用PBS溶液沖洗3次。加適量的胰蛋白酶，置于37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 min。后離心加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換一次液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長，2～5代的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 DPSCs成骨分化能力的比較

1.4.1 實驗分組 將生長良好的第3代DPSCs設(shè)置為3組：空白組為純DPSCs組，含10%FBS，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液；實驗組為DPSCs加NGF組，10%FBS，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液加入100 μg/L的NGF；對照組為DPSCs加礦化液組，10%FBS，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液加入10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸。分別在7、14 d后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.2 細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 第3代DPSCs以5×104個/孔細(xì)胞接種于24孔板中，隨機(jī)分為3組，在培養(yǎng)7、14 d時各組取一個24孔板，用0.1 mmol/L PBS沖洗3次，490 nm 處酶標(biāo)儀測吸光度值計算裂解液中ALP水平。

1.4.3 RT-qPCR檢測COL-1、Runx-2和OCN基因表達(dá) 取第三代細(xì)胞1×106個/孔接種于6孔板中分組培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)7、14 d時提取細(xì)胞RNA，第一鏈cDNA模板通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成，以β-actin為內(nèi)參對照，設(shè)置無模板陰性對照。PCR反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40循環(huán)(引物序列見表1)。

表1PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 DPSCs組織形態(tài)學(xué)觀察 酶解組織法順利培養(yǎng)出兔DPSCs，2 d即可見周圍組織塊有細(xì)胞游出(見圖1)，細(xì)胞呈集落生長，胞質(zhì)均勻，形狀呈圓形。5～6 d后可匯合達(dá)80%，此時可進(jìn)行再次傳代。實驗7、14 d時3組細(xì)胞形態(tài)見圖2。實驗7 d時，與空白組和對照組比較，實驗組細(xì)胞呈聚集性生長，梭形細(xì)胞逐漸向多角形分化；14 d時，實驗組細(xì)胞間隙增多，多角形改變更加明顯。

2.2 細(xì)胞ALP活性結(jié)果 實驗14 d時的空白組、實驗組和對照組的ALP活性值均高于7 d時的活性值(P<0.01)；實驗7 d和14 d時3組間ALP活性值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，實驗組高于空白組(P<0.05)，對照組高于實驗組(P<0.05)(見表2)。

2.3 3組兔DPSCs RT-qPCR結(jié)果 各組培養(yǎng)在7 d時實驗組中COL-1和OCN基因的表達(dá)值均高于空白組(P<0.05)；培養(yǎng)14 d時實驗組中COL-1、Runx-2和OCN基因的表達(dá)值均高于空白組(P<0.05)(見表3～5)。

表2 空白組、實驗組和對照組7、14 d的ALP活性比較

表3 兔DPSCs中COL-1基因表達(dá)情況

表4 兔DPSCs中Runx-2基因表達(dá)情況

表5 兔DPSCs中OCN基因表達(dá)情況

3 討論

DPSCs具有成骨分化能力，而且其是存在于牙髓組織中的一類成體干細(xì)胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，在口腔顱頜面部的缺損修復(fù)中具有一定的同源優(yōu)越性。自 GRONTHOS等[11]成功從成人牙髓源性細(xì)胞中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞以來，DPSCs就開始在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用。

NGF是多種組織再生中的理想細(xì)胞因子，由于其潛在的成骨誘導(dǎo)作用，也讓其成為近期的研究熱點(diǎn)[12-13]。NGF是在1952年發(fā)現(xiàn)的第一個神經(jīng)營養(yǎng)因子。早期研究證實了NGF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，可以促進(jìn)神經(jīng)的再生、營養(yǎng)和發(fā)育[14]。相關(guān)研究[15-16]顯示NGF有很好的促進(jìn)骨修復(fù)的作用，可以促進(jìn)兔脛骨骨折部位的愈合，也能促進(jìn)人體四肢骨的骨折愈合，使其愈合時間縮短。近期研究[17]顯示，NGF可在小鼠肋骨的骨折部位檢測到，2 d達(dá)到高峰值，說明NGF與骨的形成有關(guān)。

NGF可加速干細(xì)胞向成骨方向分化，因此，本研究擬在前期基礎(chǔ)上，通過ALP檢測、RT-qPCR等技術(shù)明確DPSCs體外在NGF作用下的成骨影響，研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)實驗組ALP水平明顯高于空白組，RT-qPCR結(jié)果顯示14 d時實驗組中COL-1、Runx-2和OCN基因的表達(dá)量均高于空白組，具有一定加速成骨向分化的作用。

綜上所述，本研究證實NGF體外能夠促進(jìn)兔DPSCs向成骨向分化，縮短臨床種植骨結(jié)合修復(fù)的時間，為其運(yùn)用到頜面部及種植體周圍骨缺損的修復(fù)提供新的視角和思路。