程序性壞死在心腦血管疾病及腫瘤發(fā)生中的作用及研究進展

劉星宇，張共鵬，魏艷龍，高 琴

程序性壞死(necroptosis)是繼細胞凋亡、壞死和自噬后被新發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞死亡方式，主要表現(xiàn)為典型的壞死樣形態(tài)。但與壞死相比，其過程受到一系列蛋白的精確調(diào)控。經(jīng)典的necroptosis需要由起始因子介導(dǎo)，隨即形成RIP1-RIP3-MLKL死亡復(fù)合體，同時發(fā)現(xiàn)存在由RIP3-CaMKⅡ通路介導(dǎo)的新通路。Necroptosis與多種心腦血管疾病及腫瘤的發(fā)生有關(guān)，若能對其調(diào)控方式進行抑制或阻斷可緩解相關(guān)疾病的發(fā)生，將為藥品開發(fā)及臨床治療提供新思路。

1 Necroptosis概述

通常認為，細胞的死亡包括三種形式，即細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬。但近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，一種新的細胞死亡方式被發(fā)現(xiàn)，即necroptosis。Necroptosis首次由DEGTEREV等[1]報道，他們通過研究腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和Caspase抑制劑zVAD-fmk處理的包括U937細胞在內(nèi)的多種細胞模型，發(fā)現(xiàn)Fas/TNFR受體家族在觸發(fā)典型的凋亡通路的同時激活了非凋亡的死亡途徑，并且篩選出一種可以阻礙這種壞死發(fā)生的小分子抑制劑。Necroptosis的特征介于細胞凋亡和細胞壞死之間：形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為具有凋亡和壞死的混合性特征，即細胞核凝聚、細胞膜喪失、線粒體腫脹等；細胞反應(yīng)上表現(xiàn)為自噬清除細胞殘骸。但在生化特征上，如DNA是否降解，DNA核小體間是否斷裂等尚不明確[2]。Necroptosis通路的具體機制目前尚不明確，但研究[3]表明，其最主要的發(fā)生途徑之一是“死亡受體-受體交互作用蛋白(RIPs)-線粒體-氧自由基通路”，該通路需要多種蛋白及因子參與。

2 RIPs家族成員的結(jié)構(gòu)特點

RIPs是一類具有高度保守絲氨酸和蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族，目前已發(fā)現(xiàn)的成員有7個，即RIP(RIP1)、RIP2(RICK/CARDIAK)、RIP3(RIPK3)、RIP4(DIK/PKK)、RIP5(SgK288)、RIP6(LRRK1)和RIP7(LRRK2)。這些RIPs家族成員有的介導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子，有的參與細胞死亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。7種蛋白質(zhì)最顯著的共同特征都具有類似的激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain，KD)，其中RIP1～RIP5的KD都在靠近N端的位置。除此之外，RIP1還有一個C端的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)和包含在中間結(jié)構(gòu)域(intermediate domain，ID)中的一個同源結(jié)構(gòu)基序(homotypic interaction motif，RHIM)。RIP2有一個Caspase激活募集區(qū)。RIP3也具有RHIM，但缺少C端的DD和橋梁結(jié)構(gòu)ID。RIP1和RIP3共同具有的RHIM具有極其重要的意義，在necroptosis通路中起關(guān)鍵作用。RIP4和RIP5有著共同的ID和C端錨定蛋白結(jié)構(gòu)域。RIP4主要存在于角質(zhì)細胞細胞質(zhì)中，參與NF-κB通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。RIP6和RIP7在結(jié)構(gòu)上與其他家族蛋白差異較大，除去共有的KD外，還有許多特異性的結(jié)構(gòu)，如富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)域，但它們的作用尚不明確，可能與帕金森綜合征有關(guān)聯(lián)[4-6]。

3 經(jīng)典的necroptosis通路

已知的經(jīng)典的necroptosis起始因子不止一種，暫不確定它們是否具有共同的下游信號通路。這類因子主要包括Toll樣受體家族、模式識別受體和死亡受體(death receptor,DR)家族。其中DR家族主要有腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)、Fas蛋白和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘生配基(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)受體[7-8]。目前，針對TNF-α/TNFR誘導(dǎo)的通路研究較多。當TNF-α與其受體識別并結(jié)合，TNFR迅速活化，形成聚合體。TNFR可以與RIP1的DD部分直接結(jié)合，而Fas和TRAIL受體則需要借助Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)來連接。此外，TNF受體相關(guān)結(jié)構(gòu)域(tumor necrosis factor receptor- 1-associated death domain，TRADD)也通過DD部分與TNFR1結(jié)合，TRADD又可以募集FADD。多種死亡受體與RIP1結(jié)合形成了復(fù)合體Ⅰ(NecrosomeⅠ)。隨后，胞質(zhì)中的RIP3通過與RIP1共有的RHM與NecrosomeⅠ結(jié)合，使RIP1發(fā)生磷酸化，在刺激因子作用下RIP3的Thr231和Ser232位點也發(fā)生自磷酸化形成復(fù)合體Ⅱ(NecrosomeⅡ)。FADD可以募集Caspase-8，使其自我活化，促進凋亡的進行，同時還能降解RIP1和RIP3，抑制necroptosis的發(fā)生，誘導(dǎo)經(jīng)典的外源性Caspase依賴性凋亡途徑。當使用一些抑制劑，如zVAD-fmk來阻滯Caspase-8通路時[9]，RIP1和RIP3則快速聚集，形成大量的NecrosomeⅡ。通過其KD部位的自磷酸化，一方面穩(wěn)定復(fù)合體Ⅱ的結(jié)構(gòu)，另一方面活化RIP3的功能。RIP3作用于一系列靶蛋白來促進細胞走向死亡。已經(jīng)研究的比較廣泛的糖原磷酸化酶、谷氨酸氨基連接酶和谷氨酸脫氫酶1等參與氧化呼吸鏈和三羧酸循環(huán)。RIP3能過度激活它們的功能，使其迅速產(chǎn)生高濃度的氧自由基，破壞內(nèi)膜系統(tǒng)，引發(fā)細胞壞死[6，10-12]。

4 Necroptosis在疾病中的研究進展

4.1 Necroptosis與腫瘤的研究進展 Necroptosis與多種臨床疾病都可能有著潛在的聯(lián)系。目前熱門研究方向之一是腫瘤防治。RIP1可以通過參與RIP1-NF-κB/AP-1-VEGF-C信號通路來促進膽囊癌淋巴的轉(zhuǎn)移。同時RIP1還可能促進了膽囊癌細胞株的增殖及侵襲。NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子是RIP1激活VEGF-C基因啟動子的調(diào)控開關(guān)。另有研究者評估了RIP1在乳腺癌癌組織和癌旁組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中RIP1的表達明顯高于癌旁組織，且癌組織中RIP1的表達與乳腺癌的分期、分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，從而發(fā)現(xiàn)RIP1表達增高與乳腺癌惡性程度較高有關(guān)。該研究組還發(fā)現(xiàn)RIP1參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，可能起促進癌細胞增殖的作用。紫草素誘導(dǎo)RIP-1高表達可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞程序性壞死，通過抑制過程中產(chǎn)生的ROS能夠明顯抑制necroptosis的發(fā)生。若用奧沙利鉑(L-OHP)直接作用于口腔癌細胞，細胞凋亡率較低，若用siRNA轉(zhuǎn)染來沉默RIP1后,RIP1表達明顯下降，細胞的凋亡率有所上升,沉默RIP1并合用L-OHP進行刺激,細胞的凋亡率明顯高于單用L-OHP組，提示抑制RIP1的表達可以增強L-OHP誘導(dǎo)口腔癌細胞的凋亡[13-17]。

4.2 Necroptosis與心腦血管疾病的研究進展 Necroptosis另一極具前景的研究方向為心腦血管疾病。早期研究[18]表明，在Fas缺失的細胞突變體中，心肌梗死面積下降顯著，過度表達的TNF-α或TRAF2可通過限制心肌缺血來減少由心肌缺血/再灌注引起的損傷。在小鼠中，RIP3的缺乏或CaMKⅡ的抑制對經(jīng)缺血/再灌注或阿霉素處理過的心肌細胞程序性壞死或心臟衰竭有良好的保護作用。RIP3通過氧化磷酸化來激活CaMKⅡ，進而使線粒體膜通透性增強誘發(fā)壞死。RIP3-CaMKⅡ信號通路還同時參與心肌細胞的凋亡和炎癥過程[19]。另有研究[20]通過利用Nec-1抑制RIP1-RIP3復(fù)合物的形成，對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟缺血再灌注損傷產(chǎn)生了保護作用。RIP1激酶(RIP1K)參與了體內(nèi)短暫性大腦中動脈阻塞和體外氧糖剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞增生以及膠質(zhì)瘢痕的形成。通過Nec-1使RIP1K基因沉默可以抑制星形膠質(zhì)細胞增生以及膠質(zhì)瘢痕的形成，最終促進缺血性腦中風(fēng)后期的神經(jīng)功能的恢復(fù)[21]。

5 展望

近年來，隨著學(xué)界對necroptosis的認識不斷加深，研究思路也不斷開闊。在經(jīng)典的necroptosis中除了RIP1、RIP3外還發(fā)現(xiàn)了一些其他的重要關(guān)鍵因子。Necrosome中存在著一個核心組分：混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)。MLKL是RIP3的特異性底物，在細胞程序性壞死被啟動后參與RIP3的磷酸化，即可激活necroptosis通路。另外，MLKL被磷酸化，暴露出其激酶結(jié)構(gòu)域，使其從單體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗑垠w狀態(tài)。多聚的MLKL能夠結(jié)合磷酸肌醇和心肌磷脂，從而由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜和各細胞器膜上。隨后在這些膜結(jié)構(gòu)中形成通透性孔道，破壞膜的完整性，引起細胞壞死。沒有MLKL的參與，necrosome將會被抑制在前體階段。MLKL的磷酸化是細胞程序性壞死通路中不可或缺步驟，但其缺陷對凋亡途徑影響不明顯[22]。 另外，復(fù)合物中的組分之一包括一種線粒體蛋白磷酸酶PGAM5。當necrosome與PGAM5通過MLKL相連后，PGAM5被磷酸化而激活?；罨腜GAM5再激活線粒體上動力相關(guān)蛋白1導(dǎo)致成串排列的線粒體發(fā)生線性斷裂，這一現(xiàn)象在細胞壞死發(fā)生的早期起到了非常重要的作用[23-24]。

總之，經(jīng)典的necroptosis是由一系列因子介導(dǎo)的，在Caspase-8受到抑制的條件下形成由RIP1、RIP3、MLKL、PGAM5等組成的復(fù)合體，來完成對細胞壞死誘導(dǎo)。但其破壞細胞并致使細胞壞死的具體機制尤其是下游信號通路尚不明確。而對與心血管疾病有關(guān)的RIP3-CaMKII通路介導(dǎo)的、不依賴于經(jīng)典necrosome的程序性壞死的研究也剛剛起步，其具體機制尚不明確。對necroptosis研究的不斷深入，進一步揭示其作用的分子機制，將為necroptosis相關(guān)的多種疾病的治療提供新的藥物靶點，為臨床治療提供新的思路。