Slit2 在膀胱癌中的表達(dá)、信號(hào)通路及其與患者預(yù)后關(guān)系的生物信息分析

李 揚(yáng)，王 云，李 遵，朱朝陽(yáng)

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 泌尿外科，河南 開(kāi)封475000

膀胱癌是臨床上較為常見(jiàn)的一類泌尿上皮性腫瘤。相關(guān)流行病學(xué)研究顯示，全球范圍每年膀胱癌新發(fā)病例高達(dá)45 萬(wàn)，因膀胱癌死亡的患者超過(guò)15萬(wàn)［1］。因此，膀胱癌已成為腫瘤致死的重要原因之一。然而，膀胱癌確切發(fā)病的分子機(jī)制仍不十分清楚［2］，且部分患者術(shù)后常常多次復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的重要原因。因此，在分子機(jī)制上探討膀胱癌發(fā)生、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子標(biāo)志物是目前的研究熱點(diǎn)［3-4］。

Slit2 基因定位于人4 號(hào)染色體，既往研究認(rèn)為其在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)研究［5-8］顯示，Slit2 在多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)差異表達(dá)，并與其生物學(xué)行為如侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。Slit2 在人膀胱癌中的研究報(bào)道不多。因此，本研究采用生物信息學(xué)方法探討Slit2 基因在膀胱癌中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 Slit2 表達(dá)水平分析

采用生物信息學(xué)方法首先在GTEx（https：／ ／www.gtexportal.org／home／）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索slit2 基因在人體各種組織中的表達(dá)水平。在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／portal.gdc.cancer.gov／）中分析Slit2多種腫瘤組織及在膀胱癌中的表達(dá)。采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析軟件GEPIA（http：／ ／gepia.cancer-pku.cn／detail.php）比較膀胱癌患者癌組織和癌旁組織中slit2 基因mRNA 表達(dá)水平及其與患者臨床分期的關(guān)系。

1.2 Slit2 突變分析

在用 TCGA 在線分析工具 cBioPortal（http：／ ／www.cbioportal.org／）對(duì)Robo1 的 在 膀胱癌及多種實(shí)體腫瘤中的突變情況進(jìn)行分析。包括突變種類、突變頻率及對(duì)應(yīng)的突變位置。同 時(shí)，在COSMIC（https：／ ／cancer.sanger.ac.uk／cosmic／）數(shù)據(jù)庫(kù)中分析突變頻率、單核苷酸突變位點(diǎn)及頻率。

1.3 Slit2 相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及KEGG 信號(hào)通路分析

在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建Slit2 相關(guān)基因表達(dá)的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建條件為：相互作用來(lái)源為實(shí)驗(yàn)、共表達(dá)、數(shù)據(jù)庫(kù)、基因融合等；最小相互作用評(píng)分為0.07，相互作用蛋白不超過(guò)20 個(gè)。同時(shí)在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中（https：／ ／www.genome.jp／kegg／pathway.html），對(duì)相互左右的蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行信號(hào)通路富集。

1.4 Slit2 表達(dá)與患者預(yù)后

根據(jù)Slit2 表達(dá)水平，分為高低表達(dá)組（高表達(dá)組：Slit2 基因mRNA 表達(dá)水平＞＝腫瘤組織中的中未表達(dá)數(shù)；低表達(dá)組：Slit2 基因mRNA 表達(dá)水平＜腫瘤組織中的中未表達(dá)數(shù)），比較兩組患者無(wú)疾病進(jìn)展生存（DFS）和總生存（OS）是否存在差異。高低表達(dá)組生存比較采用log-rank 建議。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用STATA12.0 軟件完成，相關(guān)基因表達(dá)、預(yù)后、突變等分析采用在線數(shù)據(jù)分析工具，雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Slit2 表達(dá)水平分析

Slit2 基因mRNA 在人體各個(gè)組織中表達(dá)水平存在差異，且組織間表達(dá)水平變異程度較大，見(jiàn)圖1A。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，Slit2 基因mRNA 在膀胱癌患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常膀胱組織（P＜0.05），見(jiàn)圖1B；且Slit2 表達(dá)水平與患者臨床分期有關(guān)，分期越高表達(dá)水平越高（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

2.2 Slit2 突變水平分析

Slit2 基因主要突變形式為融合突變、擴(kuò)增突變、深度缺失突變和多重突變等，見(jiàn)圖2A。具體突變位置，見(jiàn)圖2B。其中缺失突變占25.55%，同義突變占8.19%，無(wú)意義突變占2.01%，見(jiàn)圖3A。單核苷酸突變主要類型為C＞T（28.51%）、G＞T（13.64%）和C＞A（9.85%），見(jiàn)圖3B。

圖1 Slit2 基因mRNA 表達(dá)水平分析（A：Slit2 基因在多種組織中表達(dá)；B：Slit2 基因在膀胱癌及其癌旁組織中表達(dá)；C：R Slit2 基因表達(dá)與膀胱癌分期）

2.3 Slit2 相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)及信號(hào)通路富集

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建Slit2 相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有21 個(gè)相關(guān)基因，基因間的聯(lián)系為92，平均節(jié)點(diǎn)相關(guān)度為8.76，區(qū)域聚類指數(shù)為0.776，相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)富集明顯（P＜0.001），見(jiàn)圖4。蛋白網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因KEGG 信號(hào)通路主要富集于Ras 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路和ErbB 信號(hào)通路等，見(jiàn)表1。

2.4 Slit2 表達(dá)與患者預(yù)后

Slit2 高低表達(dá)膀胱癌患者無(wú)疾病進(jìn)展生存（DFS）和總生存（OS）間均存在明顯的差異（P＜0.05）。DFS（HR ＝1.5，P＝0.026）和OS（HR ＝1.50，P＝0.015）在Slit2 高表達(dá)組患者顯著低于低表達(dá)組，提示Slit2 高表達(dá)是膀胱癌預(yù)后不良的因素，見(jiàn)圖5。

3 討論

Slit 基因于1984 年被Jürgens 等首次于果蠅胚體中發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)売左w角色澤起到作用。1988 年Rothberg 等［9］報(bào)道Slit 蛋白可以在果蠅中樞神經(jīng)中線膠質(zhì)細(xì)胞中合成，Slit 蛋白減少可導(dǎo)致聯(lián)合（交叉）神經(jīng)元軸突和縱行傳導(dǎo)通路在中線的聚集出現(xiàn)異常。Slit 蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要由3 個(gè)成員組成，分別為Slit1、Slit2 和Slit3，三種蛋白均可于神經(jīng)系統(tǒng)中線表達(dá)，也可于其他細(xì)胞類型中表達(dá)［10-12］。近年來(lái)，陸續(xù)有研究報(bào)道Slit2 在多種人實(shí)體腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，提示Slit2 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)發(fā)揮重要作用［13-17］。

圖2 Slit2 基因突變水平分析（A：Slit2 基因主要突變形式；B：Slit2 基因突變位置）

圖3 Slit2 基因突變頻率分析（A：各種突變頻率；B：?jiǎn)魏塑账嵬蛔冾l率）

圖4 Slit2 基因相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

表1 Slit2 相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)KEGG 信號(hào)通路富集

圖5 Slit2 基因表達(dá)與膀胱癌患者生存期分析（A：高低表達(dá)患者無(wú)疾病進(jìn)展生存比較；B：高低表達(dá)患者總生存比較）

然而，關(guān)于Slit2 在膀胱癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道多，其在膀胱癌中的生物學(xué)行為及作為預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性亦不明確。因此，我們采用生物信息學(xué)的方法探討Slit2 在膀胱癌中的表達(dá)情況、相關(guān)信號(hào)通路及其與患者預(yù)后關(guān)系。研究結(jié)果顯示，Slit2 基因mRNA 在膀胱癌患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常膀胱組織（P＜0.05），且Slit2 表達(dá)水平與患者臨床分期有關(guān)。分期越高表達(dá)水平越高（P＜0.05），說(shuō)明Slit2 可能起促癌作用，在膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步分析顯示，Slit2 基因主要突變形式為融合突變、擴(kuò)增突變、深度缺失突變和多重突變等。其中缺失突變占25.55%，同義突變占8.19%，無(wú)意義突變占2.01%。上述突變的存在可能進(jìn)一步影響基因表達(dá)產(chǎn)物水平，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。Slit2 相關(guān)基因KEGG 信號(hào)通路主要富集于Ras 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路和ErbB 信號(hào)通路等。上述小信號(hào)通路大多與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)行為有關(guān)。預(yù)后分析顯示，Slit2 高低表達(dá)膀胱癌患者DFS 和OS 間均存在明顯的差異（P＜0.05）。在Slit2 高表達(dá)組患者顯著低于低表達(dá)組，提示Slit2 高表達(dá)是膀胱癌預(yù)后不良的因素。

因此，Slit2 基因在膀胱癌患者癌組織中表達(dá)水平明顯上調(diào)，高表達(dá)與膀胱癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。但研究本身單純從生物信息分析水平證實(shí)了Slit2在膀胱癌組織中存在差異表達(dá)，并與預(yù)后有關(guān)，但其結(jié)論有待進(jìn)一步相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。