聚焦PCR技術(shù)應(yīng)用 突破考試難點(diǎn)

唐建烽

摘要 PCR技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中常涉及的重要技術(shù)，也是高中生物教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。由于高中實(shí)驗(yàn)室條件限制，學(xué)生缺少實(shí)操演習(xí)，學(xué)習(xí)難度大，考試得分率低。通過對考試題目中常見的PCR應(yīng)用類型進(jìn)行總結(jié)和梳理，希望幫助學(xué)生突破學(xué)習(xí)難點(diǎn)，起到舉一反三的作用。

關(guān)鍵詞 PCR 應(yīng)用 基因工程 高中生物

中圖分類號 G633.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

PCR是一種以特定靶DNA片段為模板，以目的基因特異性堿基序列設(shè)計(jì)的引物為起點(diǎn)，在耐高溫DNA聚合酶催化下，通過反復(fù)的高溫變性、低溫退火、中溫延伸等步驟，快速、特異性地體外復(fù)制出目的DNA片段的技術(shù)。自PCR發(fā)明以來，科研人員在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量改進(jìn)，開發(fā)了適用于不同生物學(xué)研究目的的PCR技術(shù)，如反向PCR、不對稱PCR、實(shí)時(shí)PCR、數(shù)字PCR技術(shù)。由于PCR具有敏感、特異、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、疾病檢驗(yàn)、遺傳病診斷、基因進(jìn)化研究等領(lǐng)域，對分子生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了深刻影響。在以“真科學(xué)考查真素養(yǎng)”為背景下的高考試題中，試題內(nèi)容多選用前沿科技成果作為素材進(jìn)行命制，以真實(shí)的科研研究創(chuàng)建真實(shí)的科學(xué)探究情景和研究任務(wù)。PCR作為現(xiàn)代分子生物學(xué)常用的技術(shù)，高考試題經(jīng)常涉及對PCR技術(shù)應(yīng)用的考查，且考查方法多種多樣。

1基因工程操作程序中的應(yīng)用

這類知識考查的原型是《選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》中有關(guān)基因工程基本操作程序的相關(guān)知識。PCR技術(shù)可用于獲取和擴(kuò)增目的基因、增添酶切位點(diǎn)、檢測目的基因是否正向連接等。

1.1獲取和擴(kuò)增目的基因

科學(xué)家常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。RT-PCR是從mRNA獲得cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)通常需要提取總RNA，以其中mRNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以cDNA為模板，以目的基因特異性堿基序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可獲得大量目的基因。

【例1】乳頭瘤病毒（HPV）是一種DNA病毒?？蓪?dǎo)致人患宮頸癌。科研人員將HPV某外殼蛋白A基因構(gòu)建成表達(dá)載體，經(jīng)包裝或直接注入體內(nèi)，表達(dá)出相應(yīng)抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。該方法獲得的疫苗稱為DNA疫苗。獲取A基因的方法：從宿主細(xì)胞中提取總RNA，以與互補(bǔ)的一段單鏈DNA作為引物，加入逆轉(zhuǎn)錄酶獲得，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大量的A基因。

參考答案：A基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA;cDNA。

1.2增加酶切位點(diǎn)

在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，為使目的基因和載體產(chǎn)生相同的末端以便于拼接，需要用同種限制酶切處理二者。實(shí)際操作中往往會出現(xiàn)目的基因兩側(cè)沒有合適的酶切位點(diǎn)，為解決該問題可以在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，在引物的5′端添加合適的堿基序列從而增加酶切位點(diǎn)。

【例2】（2020·海淀一模）研究人員選取啟動子sul準(zhǔn)備與圖1表達(dá)載體連接。圖2顯示了啟動子sul內(nèi)部存在的酶切位點(diǎn)，箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。

依據(jù)圖1，克隆啟動子sul時(shí)，在其A端和B端應(yīng)分別添加限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，從而確保啟動子sul可與已被酶切的表達(dá)載體正確連接。

解析：在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)需要注意不能破壞啟動子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因等結(jié)構(gòu)，此外還要注意連接方向，從而保證目的基因的正常表達(dá)。由于啟動子中含有SmaI和HindIII，因此只能選擇SapI和XhoI。由于轉(zhuǎn)錄方向?yàn)锳到B，因此在A端添加XhoI，在B端添加SapI。

參考答案：XhoI和SapI。

1.3目的基因是否正向連接

【例3】（2019·江蘇卷）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖3所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對引物是。某學(xué)生嘗試用圖3中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是

解析：根據(jù)目的基因插入的位置和PCR技術(shù)的原

理分析，PCR擴(kuò)增時(shí)選擇的一對引物要位于目的基因的上游和下游，因此只能選擇甲丙或者乙丙組合。若選擇甲丙組合，無論目的基因是否正確連接，擴(kuò)增的片段都是450bp，不符合要求;若選擇乙丙組合，正向連接可擴(kuò)增的片段為350bp，若反向連接，因?yàn)橐镂挥谝粋?cè)，則不可以擴(kuò)增。根據(jù)題意和圖形分析，某同學(xué)用圖中的另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp的片段（等于300bp+100bp），說明選擇的是引物甲和乙，且乙引物應(yīng)該位于重組質(zhì)粒的外側(cè)，目的基因發(fā)生了反向連接。

參考答案：乙、丙;目的基因反向連接。

1.4目的基因的檢測與鑒定

目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，是轉(zhuǎn)基因成功的重要一步?？梢酝ㄟ^PCR技術(shù)檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞以及檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。

【例4】用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到圖4所示的電泳圖譜。其中1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液，10號為蒸餾水，PCR時(shí)加入的模板DNA如圖4所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是（）

A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500bp之間

B.3號樣品為不含目的的基因的載體DNA

C.9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株

D.10號確定反應(yīng)體系等對結(jié)果沒有干擾

解析：PCR技術(shù)是基因工程中常用的檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法。提取受體細(xì)胞的總DNA，以載體為模板進(jìn)行PCR，之后再進(jìn)行電泳檢測。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，最好一個(gè)引物與載體DNA互補(bǔ)結(jié)合，另一個(gè)引物與目的基因DNA互補(bǔ)結(jié)合，并以重組DNA為模板才可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖可知，3～8號有擴(kuò)增條帶，分子大小在400bp左右，3號作為參照，應(yīng)為不含目的的基因的載體DNA。因9號PCR結(jié)果無擴(kuò)增條帶，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株。

參考答案：B。

【例5】（2017·石景山一模）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II在腫瘤細(xì)胞中含量明顯高于正常細(xì)胞。華蟾素注射液處理HepG-2細(xì)胞48h后：提取HepG-2細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，PCR擴(kuò)增并進(jìn)行電泳。圖5所示電泳條帶的寬窄代表。

解析：由于mRNA在組織細(xì)胞中的含量很低不易檢測且不可以直接擴(kuò)增，因此需要將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增，通過cDNA的擴(kuò)增量間接反映目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。

參考答案：TopoII基因轉(zhuǎn)錄水平。

2檢測突變體基因型

土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，在侵染植物細(xì)胞時(shí)，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移，插入植物染色體DNA中，Ti質(zhì)粒上這一段能轉(zhuǎn)移的DNA叫做T-DNA?？茖W(xué)家常利用T-DNA這一特性，用于植物基因功能研究及植物突變體的培育。若明確知道T-DNA插入的位點(diǎn)，可根據(jù)插入位點(diǎn)基因及T-DNA特異性核苷酸序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR;再進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶的差異即可判斷基因型是純合子還是雜合子。

【例6】（2015·海淀一模）為驗(yàn)證F2植株基因型及比例，研究者根據(jù)D基因、T-DNA的序列，設(shè)計(jì)了3種引物，如圖6所示。

隨機(jī)選取F2植株若干，提取各植株的總DNA，分別用引物“I+III”組合及“II+III”組合進(jìn)行PCR（完整的T-DNA過大，不能完成PCR），檢測是否擴(kuò)增。若，則相應(yīng)植株的基因型為Dd;同理可判斷其他基因型，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)各基因型比例。解析：由圖可知，引物II和III分為與D基因的兩側(cè)的堿基序列互補(bǔ)，引物I與T-DNA上面的單鏈堿基互補(bǔ)。由于完整的T-DNA過大，不能完成PCR，D基因只能通過引物“II+III”組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，d基因只能通過若引物“I+III”組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。因此，若僅引物“II+III”組合可以擴(kuò)增，則相應(yīng)植株的基因型為DD;若僅引物“I+III”組合可以擴(kuò)增，則相應(yīng)植株的基因型為dd;若引物“I+III”組合及“II+III”組合都可以擴(kuò)增，則相應(yīng)植株的基因型為Dd。參考答案：引物“I+III”組合及“II+III”組合均可以擴(kuò)增。

3誘導(dǎo)基因突變

在PCR過程時(shí)，通過設(shè)計(jì)堿基錯(cuò)配的引物，可以實(shí)現(xiàn)對目的基因的定點(diǎn)突變，也可以通過替換基因片段的方式實(shí)現(xiàn)基因的突變，從而實(shí)現(xiàn)對基因功能的研究。

【例7】（2018·海淀區(qū)高三期中）檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低，研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個(gè)堿基），并按圖7所示方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，以得到新的蛋白A基因。圖7所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖中所示的引物？請?zhí)顚懕?（若選用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”）。

解析：由題目可知，該方法的主要原理是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笤O(shè)計(jì)堿基錯(cuò)配的引物B和C。以蛋白A基因?yàn)槟０?，引物A和B構(gòu)建PCR反應(yīng)體系1。以引物C和D構(gòu)建PCR反應(yīng)體系2。將PCR反應(yīng)產(chǎn)出物1和2混合后構(gòu)建PCR反應(yīng)體系3，由于引物B和C堿基序列互補(bǔ)，所以兩個(gè)PCR產(chǎn)物會連接在一起。在DNA聚合酶的作用下兩條單鏈會沿著5′到3′的方向延伸，從而得到等長的PCR產(chǎn)物3。再以PCR產(chǎn)物3為模板加入引物A和D，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系4。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后即可得到實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變的基因片段。

4疾病、食品安全的檢測

實(shí)時(shí)定量PCR是一種檢測樣品中特定核酸含量的PCR反應(yīng)。一般使用帶有熒光標(biāo)記的引物，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號強(qiáng)度也按照特定的規(guī)律隨PCR產(chǎn)物不斷累積而增加。每經(jīng)過一個(gè)熱循環(huán)，定量PCR儀通過熒光檢測系統(tǒng)接收熒光信號強(qiáng)度，檢測PCR擴(kuò)增后所得產(chǎn)物量。通過連續(xù)檢測得到的反應(yīng)動力學(xué)曲線，可計(jì)算出樣品中模板DNA的初始含量。該技術(shù)在科研工作中應(yīng)用廣泛，可用于疾病和食品安全的檢測、對比相同基因在不同組織中相對表達(dá)量等。

【例8】將新冠病毒不穩(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)換成DNA后，技術(shù)人員常采用熒光定量PCR技術(shù)定量檢測樣本中病毒的核酸含量。其原理如圖9所示，在PCR反應(yīng)體系中每加入一對引物的同時(shí)，加入一個(gè)與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)Taq酶催化子鏈延伸至探針處，會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接受到熒光信號，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成。反應(yīng)最終的熒光強(qiáng)度與PCR起始狀態(tài)的含量呈正相關(guān)。

解析：在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶遇到探針時(shí)會使熒光探針?biāo)?，因此，擴(kuò)增次數(shù)越多，樣品中病毒初始數(shù)量（病毒樣品模板RNA含量）越多，反應(yīng)最終的熒光強(qiáng)度與起始狀態(tài)模板DNA含量呈正相關(guān)。

參考答案：模板DNA。

PCR方法自建立至今，極大地推進(jìn)了生命科學(xué)研究的發(fā)展，也定會隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展繼續(xù)被優(yōu)化。筆者僅僅是對考試題目中常見的PCR應(yīng)用類型進(jìn)行總結(jié)，無法完整囊括所有類型的應(yīng)用，如將PCR用于性別鑒定、動植物DNA分型研究和基因進(jìn)化研究等。希望通過以上的總結(jié)能夠幫助學(xué)生加深對PCR的理解，對PCR相關(guān)題目的解答起到觸類旁通的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]張禮堃，鄒秉杰，宋沁馨，周國華.PCR技術(shù)在新冠病毒核酸檢測中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2021，34（5）：539-544.

[2]孫娟.明悉引物設(shè)計(jì)參透PCR技術(shù)[J].生物學(xué)教學(xué)，2019，44（3）：37-40.

[3]祁洋，李燕，王永智，尉亞輝.擴(kuò)增T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的方法及其應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（17）：7907-7908，7927.

[4]徐芳，姚泉洪，熊愛生，彭日荷，侯喜林，曹兵.重疊延伸PCR技術(shù)及其在基因工程上的應(yīng)用[J].分子植物育種，2006，（5）：747-750.