基于生物信息學(xué)整合分析醒脾舒肝湯調(diào)節(jié)自噬治療中醫(yī)郁病的分子機(jī)制*

楊仁義，龔翠蘭，車(chē)雄宇，顏思陽(yáng)，周德生，傅馨瑩，陸展輝

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南常德415000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007

中醫(yī)郁病主要以心情抑郁、煩躁易怒、精神恍惚、悲傷欲哭、脅肋脹痛、全身不適等為主要癥狀［1］，西醫(yī)屬于“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”等范疇。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)2020年后抑郁癥可能成為人類(lèi)健康問(wèn)題的第二大因素［2］。西醫(yī)一般予以阿米替林、氟西汀等藥物治療，其作用機(jī)制主要與神經(jīng)鞘磷脂在溶酶體和高爾基膜中的緩慢蓄積，及神經(jīng)酰胺在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的緩慢蓄積，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞的自噬有關(guān)［3-4］。自噬是一種溶酶體依賴性降解、回收、利用機(jī)體內(nèi)大分子和細(xì)胞器的程序性死亡方式，受LC3-II、Beclin、p62、Vps等多種分子及信號(hào)通路調(diào)控，參與機(jī)體復(fù)雜生理病理過(guò)程，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。中醫(yī)從整體觀念、辨證論治的角度出發(fā)，在郁病的依從性、接受度、癥狀改善及療效等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，加味逍遙散能刺激自噬小體的形成，并激活A(yù)TG5及LC3-II的表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善抑郁癥狀，所以，中醫(yī)藥可能通過(guò)激活自噬機(jī)制發(fā)揮抗抑郁作用［6］。本研究根據(jù)郁病病因病機(jī)，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，郁病病機(jī)屬脾虛濕盛，肝郁氣滯的范疇，治法當(dāng)以醒脾疏肝為主，基于此理論立方的醒脾舒肝湯，由麻黃、紅花、川芎、細(xì)辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術(shù)、白芍、香附組成。該藥在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用中取得了較好的療效，但是其分子機(jī)制尚不明確。本研究從神經(jīng)細(xì)胞自噬機(jī)制出發(fā)，整合中藥及疾病靶點(diǎn)大數(shù)據(jù)，采用計(jì)算機(jī)技術(shù)多學(xué)科交叉分析方法，揭示醒脾舒肝湯調(diào)控自噬通路治療郁病的分子機(jī)制，為后續(xù)機(jī)制驗(yàn)證及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)醒脾舒肝湯提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 醒脾舒肝湯活性化合物收集及篩選利用TCMSP［7］（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)，收集醒脾舒肝湯中麻黃、紅花、川芎、細(xì)辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術(shù)、白芍、香附10味中藥的主要化學(xué)成分。根據(jù)人體對(duì)藥物吸收、分布、代謝及毒性的藥代動(dòng)力學(xué)ADMT參數(shù)［8］，以口服生物利用度［9］（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類(lèi)藥性［10］（drug likeness，DL）≥0.18，血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3為篩選條件［11］，初步篩選出醒脾舒肝湯有效高活性化合物。

1.2 活性化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與“中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)篩選通過(guò)PubChem［12］（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）數(shù)據(jù)庫(kù)收集各活性化合物成分信息，以2D、3D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式。將活性化合物導(dǎo)入Swiss Target Prediction［13］（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)活性化合物相關(guān)靶點(diǎn)，剔除無(wú)化學(xué)結(jié)構(gòu)、無(wú)靶點(diǎn)的化合物。

通過(guò)Pubmed中“MeSH”檢索功能檢索“anxiety neurosis（MeSH）”“depressive disorder（MeSH）”“somatoform disorder（MeSH）”及“autophagy（MeSH）”，收集所有檢索詞。將“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”及“自噬”的所有檢索詞納入GeneCards（https：／／www.genecards.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，收集“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”和“自噬”的作用靶點(diǎn)。

通過(guò)Bioinformatics Gent（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）中Van de Peer Lab在線工具取交集獲得“醒脾舒肝湯”“郁病”“自噬”的“中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.3 共同靶點(diǎn)關(guān)鍵基因篩選及蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)String［14］（https：／／string-db.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)，將所得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入，選擇Multiple Protenin，限定物種為Homo sapiens，設(shè)定最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為最高可信度0.900［15］，得到PPI相關(guān)信息。

將導(dǎo)出的PPI相關(guān)信息中Node1、Node2、Combined score值導(dǎo)入Cytoscape軟件，使PPI相關(guān)信息網(wǎng)絡(luò)圖可視化，并利用Network analyzer計(jì)算Degree值，進(jìn)行可視化。同時(shí)采用Cytoscape軟件中Cyto-Hubba、MCODE功能中MCC算法、MCODE算法分別對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行亞網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選出關(guān)鍵基因，將3種算法篩選出的基因取并集，整合出共同靶點(diǎn)關(guān)鍵基因。

1.4 共同靶點(diǎn)GO 和KEGG 富集分析

利用WebGestalt［16］（http：／／www.webgestalt.org／＃）數(shù)據(jù)庫(kù)，將共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析。初步設(shè)定基本參數(shù)，物種為“Homo sapiens”，采用“ORA”（Over-Representation Analysis，ORA）算法分析，選用“Funtional Database”子數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO和KEGG富集分析。進(jìn)階參數(shù)設(shè)定中，設(shè)定“Significance Level”P(pán)＜0.05，余為默認(rèn)設(shè)置。收集BP、CC、MF、KEGG富集分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行“加權(quán)集合覆蓋”分析，并繪制火山圖。

同時(shí)利用Metascape［17］（http：／／metascape.org／gp／index.html＃／main／step1）數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)入共同靶點(diǎn)，基于MCODE算法對(duì)KEGG富集分析進(jìn)行聚類(lèi)亞網(wǎng)絡(luò)分析，并進(jìn)行可視化。

1.5 關(guān)鍵基因非編碼RNA（m iRNA）反向預(yù)測(cè)及多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式構(gòu)建

利用TargetScan［18-20］（http：／／www.targetscan.org／mamm_31／）數(shù)據(jù)庫(kù)反向預(yù)測(cè)關(guān)鍵基因mRNA的miRNA，篩選并收集保守性miRNA，同時(shí)利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNAmRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式。

2 結(jié)果

2.1 醒脾舒肝湯活性化合物篩選通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共收集醒脾舒肝湯中化合物422個(gè)，其中麻黃363個(gè)，紅花189個(gè)，川芎189個(gè)，細(xì)辛192個(gè)，艾葉135個(gè)，柴胡349個(gè)，吳茱萸176個(gè)，白術(shù)55個(gè)，白芍85個(gè)，香附104個(gè)。初步篩選后得出醒脾舒肝湯有效高活性化合物，麻黃10個(gè)，紅花12個(gè)，川芎6個(gè)，細(xì)辛6個(gè)，艾葉7個(gè)，柴胡9個(gè)，吳茱萸21個(gè)，白術(shù)4個(gè)，白芍3個(gè)，香附10個(gè)，基本信息見(jiàn)表1。

2.2 活性化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與“中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)篩選通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選化合物相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，剔除無(wú)化學(xué)結(jié)構(gòu)及無(wú)靶點(diǎn)化合物，得到醒脾舒肝湯中麻黃、紅花、川芎、細(xì)辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術(shù)、白芍、香附共4 025個(gè)靶點(diǎn)，重復(fù)靶點(diǎn)整合后得到799個(gè)中藥靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集得到中醫(yī)郁病靶點(diǎn)，即“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”，共得到8 364個(gè)抑郁癥疾病靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集得到自噬靶點(diǎn)，共得到5 096個(gè)自噬表型靶點(diǎn)。利用Bioinformatics Gent取交集獲得“中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)，共同靶點(diǎn)312個(gè)，繪制韋恩圖見(jiàn)圖1，共同靶點(diǎn)見(jiàn)表2。

圖1 “中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及亞網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隼肧tring數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件對(duì)共同靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，得出PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2A）。設(shè)定1≤Degree值≤10為綠色；11≤Degree值≤20為紫色；21≤Degree值≤30為粉紅色；31≤Degree值≤63為紅色，根據(jù)Network analyzer分析中Degree值設(shè)定節(jié)點(diǎn)大小，Degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大。同時(shí)采用PPI網(wǎng)絡(luò)圖亞網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，MCC算法、MCODE算法結(jié)果分別見(jiàn)圖2B，圖2C，整合3種算法得到的基因，取三者并集得到關(guān)鍵基因39個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 醒脾舒肝湯中有效高活性化合物基本信息

續(xù)表1 醒脾舒肝湯中有效高活性化合物基本信息

表2 “中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)

PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有312個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 627條邊，P-value＜＜1.0e-16，平均節(jié)點(diǎn)度為10.4，聚類(lèi)系數(shù)為0.459，其中Degree值大于30的基因?yàn)镾RC（Degree值 ＝63）；MAPK1（Degree值 ＝62）；PIK3CA（Degree值＝61）；PIK3R1（Degree值＝58）；MAPK3（Degree值＝58）；STAT3（Degree值＝57）；AKT1（Degree值＝53）；FYN（Degree值＝53）；LYN（Degree值＝46）；HSP90AA1（Degree值＝45）；PTPN11（Degree值＝39）；RAC1（Degree值＝39）；RHOA（Degree值＝38）；MAPK8（Degree值＝35）；CREBBP（Degree值＝35）；EGFR（Degree值＝35）；APP（Degree值＝35）；PTK2（Degree值＝34）；JUN（Degree值＝33）；JAK2（Degree值＝33）；JAK1（Degree值＝33）；MAPK14（Degree值＝33）。

圖2 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖及亞網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰣D

表3 整合Degree、MCC、MCODE算法的關(guān)鍵基因

2.4 共同靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析BP富集結(jié)果，共富集537個(gè)生物過(guò)程，加權(quán)集合覆蓋分析出10個(gè)最相關(guān)生物過(guò)程，根據(jù)“P-Value”升序排列，主要富集于對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、蛋白質(zhì)絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控、肽基酪氨酸修飾、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)等生物進(jìn)程。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3A。

CC富集結(jié)果，共富集34個(gè)細(xì)胞成分，加權(quán)集合覆蓋分析出10個(gè)最相關(guān)細(xì)胞成分，根據(jù)“P-Value”升序排列，主要富集于膜區(qū)、受體復(fù)合體、神經(jīng)細(xì)胞體、膜面、谷氨酸能突觸等。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3B。

MF富集結(jié)果，共富集71個(gè)分子功能類(lèi)別，加權(quán)集合覆蓋分析出10個(gè)最相關(guān)分子功能類(lèi)別，根據(jù)“P-Value”升序排列，主要富集于蛋白質(zhì)絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、磷蛋白結(jié)合等。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3C。

KEGG富集結(jié)果，共富集154條信號(hào)通路，加權(quán)集合覆蓋分析出10條最相關(guān)信號(hào)通路，根據(jù)“P-Value”升序排列，主要為癌癥途徑、MicroRNA通路、細(xì)胞凋亡、AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗、MAPK信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3D。

Metascape［17］數(shù)據(jù)庫(kù)MCODE算法對(duì)KEGG富集分析進(jìn)行聚類(lèi)亞網(wǎng)絡(luò)分析，并進(jìn)行可視化，共同靶點(diǎn)主要聚9類(lèi)，主要以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類(lèi)為主，Ⅰ類(lèi)靶點(diǎn)主要富集于R-HSA-9006934、R-HSA-449147、R-HSA-5674499通路；Ⅱ類(lèi)靶點(diǎn)主要富集于R-HSA-9006925、R-HSA-449147、RHSA-1257604通路；Ⅲ類(lèi)靶點(diǎn)主要富集R-HSA-5633007、R-HSA-9006934、R-HSA-3700989通路，Ⅳ類(lèi)靶點(diǎn)主要富集于R-HSA-418594、RHSA-373076、R-HSA-500792通路，具體結(jié)果見(jiàn)圖4、表4。

圖3 共同靶點(diǎn)GO、KEGG富集分析結(jié)果圖

圖4 KEGG聚類(lèi)亞網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.5 關(guān)鍵基因m iRNA預(yù)測(cè)分析TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中反向預(yù)測(cè)39個(gè)關(guān)鍵基因的保守性miRNA，其中8個(gè)關(guān)鍵基因CCR5、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCL8、DRD3、HCK、PTGDR2未預(yù)測(cè)到miRNA，共919個(gè)miRNA-mRNA相互作用關(guān)系，在Cytoscape軟件中將共同靶點(diǎn)的mRNA設(shè)置為“三角形”“紅色”；將反向預(yù)測(cè)的miRNA設(shè)置為“圓形”“藍(lán)色”，可視化如圖5。

表4 KEGG聚類(lèi)亞網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

圖5 關(guān)鍵基因mRNA-m iRNA相互作用預(yù)測(cè)關(guān)系圖

3 討論

郁病源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，發(fā)展于《傷寒雜病論》?！端貑?wèn)·六元正紀(jì)大論》中談及郁病甚者，木、火、土、金、水郁分別當(dāng)以達(dá)、發(fā)、奪、瀉、折為法治療，從而奠定了郁病學(xué)說(shuō)的基礎(chǔ)。《素問(wèn)· 舉痛論》云：“思則心有所存，神有所歸，正氣留而不行，故氣結(jié)矣。”提出郁病與情志之間的病因關(guān)系。此后，張仲景《傷寒論》《金匱要略·婦人雜病脈證治》從六經(jīng)辨證理論出發(fā)，認(rèn)為郁病屬少陽(yáng)之樞，氣機(jī)升降出入、樞紐開(kāi)合、肝木調(diào)達(dá)都賴肝膽疏泄，并創(chuàng)小柴胡湯。郁病多與情志有關(guān)，情志過(guò)極則氣血失和，氣機(jī)不暢，不思飲食，郁久五臟俱傷，主要累及肝脾兩臟，氣滯及痰濕內(nèi)生，則肝郁氣滯兼有脾虛濕盛，當(dāng)以疏肝行氣，醒脾祛濕治之。根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合肝郁氣滯兼有脾虛濕盛病機(jī)，制定具有疏肝行氣、醒脾祛濕功效的醒脾舒肝湯，由麻黃、紅花、川芎、細(xì)辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術(shù)、白芍、香附按特定比例組成，同時(shí)采用中醫(yī)定向透藥聯(lián)合灸法的方式，臨床治療軀體形式障礙、焦慮抑郁狀態(tài)取得了較好的療效。

生物信息學(xué)是生物醫(yī)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)的綜合體，利用數(shù)學(xué)分析方法，已成為系統(tǒng)生命學(xué)的重要組成部分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以中藥為研究對(duì)象，以大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，研究中藥潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制，為推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化創(chuàng)造了巨大的潛力。分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘分析是DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物分子以網(wǎng)絡(luò)整體調(diào)控模式參與機(jī)體生命過(guò)程?！氨孀C論治”“整體觀念”是中醫(yī)學(xué)基本特色，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘等生命信息學(xué)從系統(tǒng)整體對(duì)藥物、疾病、機(jī)制進(jìn)行科學(xué)認(rèn)識(shí)，兩者具有高度契合性。本研究采用生物信息學(xué)方法，挖掘醒脾舒肝湯活性成分、篩選分析“中藥—疾病—表型”共同靶點(diǎn)，從分子、基因角度研究其作用機(jī)制。

本研究收集醒脾舒肝湯麻黃、紅花、川芎、細(xì)辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術(shù)、白芍、香附中化合物共422個(gè)，初步篩選得到具有良好生物活性及口服利用度的化合物，已被文獻(xiàn)報(bào)道具有抗脂類(lèi)沉積、抗損傷、免疫調(diào)節(jié)等活性。如Vanmierlo等［21］研究發(fā)現(xiàn)，麻黃活性化合物谷固醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）能通過(guò)影響腦膽固醇穩(wěn)態(tài)改善Abcg5-／-小鼠焦慮行為，López-Rubalcava等［22］研究發(fā)現(xiàn)β谷固醇能使GABA（A）與其受體結(jié)合形成復(fù)合物，從而發(fā)揮抗抑郁作用。Li等［23］通過(guò)代謝組學(xué)的方法揭示了豆甾醇能應(yīng)激抗性大鼠外周血單核細(xì)胞的潛在抗抑郁和抗逆機(jī)制，其作用機(jī)制可能與能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)、O-GlcNAcylation和cAMP信號(hào)級(jí)聯(lián)等有關(guān)。由此可見(jiàn)，篩選所得醒脾舒肝湯的活性化合物具有抗抑郁的作用。

本研究以中醫(yī)“郁病”作為切入點(diǎn)，中西醫(yī)結(jié)合對(duì)應(yīng)研究“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”的作用機(jī)制可能與自噬有關(guān)［3］，結(jié)合GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘“中藥—疾病—表型”，即“醒脾舒肝湯—郁病—自噬”的共同靶點(diǎn)共312個(gè)，充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，驗(yàn)證了醒脾舒肝湯可能以其多成分、多靶點(diǎn)、整體協(xié)同方式通過(guò)自噬機(jī)制發(fā)揮抗抑郁的作用。進(jìn)一步分析共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)合MCC算法、MCODE算法及拓?fù)浞治?，篩選出“醒脾舒肝湯—郁病—自噬”調(diào)控關(guān)系中關(guān)鍵基因39個(gè)，其中已有文獻(xiàn)報(bào)道，淀粉樣前體蛋白［24］被證實(shí)是NRF1基因網(wǎng)絡(luò)的靶基因，參與人腦多種疾病的發(fā)生，其中包括焦慮抑郁。JUN基因在外周血中過(guò)表達(dá)，可作為抑郁治療的預(yù)測(cè)分子［25］，能增強(qiáng)自噬，穩(wěn)定焦慮抑郁情緒［26］。由此可見(jiàn)，多個(gè)關(guān)鍵基因既能作為郁病治療的預(yù)測(cè)靶標(biāo)，也能參與增強(qiáng)自噬途徑，從而發(fā)揮抗抑郁穩(wěn)定情緒的作用。

本研究對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行富集分析，主要富集于膜區(qū)、受體復(fù)合體、突觸等細(xì)胞成分，通過(guò)磷酸化、泛素化等直接作用機(jī)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性及蛋白結(jié)合能力等，影響蛋白—蛋白、蛋白—DNA、蛋白—RNA相互作用關(guān)系，從而影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控及氧利用等生物進(jìn)程，其主要作用機(jī)制可能與MicroRNA通路、細(xì)胞凋亡、AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗等多通路網(wǎng)絡(luò)模式調(diào)控自噬通路有關(guān)。Wang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，逍遙散加減能通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制介導(dǎo)自噬小體形成，增強(qiáng)自噬從而發(fā)揮抗抑郁作用，證實(shí)細(xì)胞凋亡與自噬表型嵌套模式能發(fā)揮協(xié)同抗抑郁作用。Gulbins等［3］研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥通過(guò)誘導(dǎo)鞘磷脂神經(jīng)酰胺控制的自噬發(fā)揮作用，其作用機(jī)制主要與酪氨酸激酶受體通路調(diào)控自噬發(fā)揮抗焦慮作用有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞介素-10介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路［27］，激活下游自噬通路［28］，從而發(fā)揮抗焦慮抑郁作用。由此可見(jiàn)，關(guān)鍵基因能在多細(xì)胞成分、多分子功能、多生物進(jìn)程中與多條通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控有關(guān)。結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道得出，醒脾舒肝湯在細(xì)胞膜區(qū)改變膜蛋白結(jié)構(gòu)，影響蛋白與蛋白、RNA、DNA結(jié)合，影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的生物進(jìn)程抗焦慮抑郁，其機(jī)制可能與網(wǎng)絡(luò)化調(diào)控多通路機(jī)制介導(dǎo)自噬增強(qiáng)有關(guān)。

本研究進(jìn)一步以miRNA通路介導(dǎo)自噬增強(qiáng)為方向，反向預(yù)測(cè)關(guān)鍵蛋白相關(guān)miRNA，得出919個(gè)miRNA與關(guān)鍵蛋白mRNA 相互作用關(guān)系。Ma等［29］高通量測(cè)序結(jié)果顯示，miR-378、miR-34b、miR-194、miR-206、miR-10a、miR-10a、let-7a、miR-34c、miR-34b、miR-21a等在抑郁樣行為的小鼠中異常表達(dá)，并且熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)異常表達(dá)的miRNA-mRNA相互作用，參與GABA能突觸、自噬通路、神經(jīng)遞質(zhì)合成等多種機(jī)制發(fā)揮抗抑郁作用，其中高通量篩選及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與本研究預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。由此可見(jiàn)，miRNA-mRNA相互作用模式可能通過(guò)調(diào)控自噬發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，基于生物信息學(xué)方法分析醒脾舒肝湯治療郁病的作用，預(yù)測(cè)其治療的關(guān)鍵基因，富集分析得出關(guān)鍵基因的蛋白互作關(guān)系、生物進(jìn)程和信號(hào)通路，同時(shí)采用miRNA-mRNA模式反向預(yù)測(cè)關(guān)鍵基因的miRNA，最終得出醒脾舒肝湯多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多miRNA參與增強(qiáng)自噬機(jī)制發(fā)揮抗抑郁作用，為中醫(yī)郁病治療，西醫(yī)抑郁癥、焦慮癥、軀體形式障礙的治療提供理論靶點(diǎn)及臨床預(yù)測(cè)標(biāo)志物，推進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合診斷治療郁病的發(fā)展，同時(shí)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)醒脾舒肝湯提供分子層面依據(jù)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供預(yù)測(cè)理論基礎(chǔ)。