補腎法對惡性腫瘤骨轉移模型小鼠的作用價值

張士強 吳婷婷 李蕓 周張杰 楊蘊 蔣海燕 夏曉婷 鐘薏

骨骼是各種惡性腫瘤發(fā)生轉移后較常累及的器官，其中肺癌患者中約有一半以上會發(fā)生骨轉移，且骨轉移多發(fā)生在肺癌晚期，嚴重影響患者的生存質量[1-2]。肺癌發(fā)生骨轉移可引起骨痛、病理性骨折、神經(jīng)壓迫及高血鈣等表現(xiàn)，嚴重者可危及生命[3]。目前臨床上針對肺癌骨轉移的治療手段主要是化療、放療、手術治療及藥物治療[4]。近年來中藥治療逐漸用于腫瘤治療方面，且在抗腫瘤轉移的研究上取得了一定進展，國內(nèi)研究者采用補腎方治療腫瘤骨轉移發(fā)現(xiàn)補腎法可以明顯延長出現(xiàn)新的轉移灶的時間[5]。相關文獻報道骨保護蛋白、核因子-κB受體活化因子和核因子-κB受體活化因子配體三種因子可通過參與破骨細胞的活化及發(fā)育過程參與肺癌骨轉移的過程[6]。本研究從RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)進一步探討補腎法對肺癌骨轉移抑制的作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑、藥物及儀器

C57BL/6雄性小鼠，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，并在無特殊病原體(SPF級)環(huán)境下飼養(yǎng)。Lewis肺癌細胞株；甲醇(上海振興化工廠)；唑來磷酸(上海藥物食品檢驗所批號為100778-200501)；補腎方由本院藥劑科提供，其主要成分有淫羊藿30 g，山茱萸30 g，骨碎補30 g，山慈菇30 g，壁虎9 g，制附子12 g，女貞子30 g，干蟾皮9 g，鱉甲9 g，蜂房9 g，自然銅30 g，黃精15 g，延胡索30 g。

1.2 左后肢股骨注射Lewis肺癌細胞株制備肺癌骨轉移動物模型

取對數(shù)生長期體外培養(yǎng)的Lewis肺癌細胞株，造模前一天將其換上新鮮培養(yǎng)液，造模當天用平衡鹽溶液PBS制成含0.5×108個/mL細胞懸液濃度(含細胞1×106個)的單細胞懸液。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，用1 mL注射器針頭在麻醉后的小鼠左側股骨處穿刺鉆孔，進針深約3～4 mm，感到有阻力時停止進針，此時慢慢推注腫瘤細胞懸液。注射完畢后消毒傷口，將鼠放回籠中，飼養(yǎng)3周并嚴密觀察。

1.3 分組與用藥

將18只造模小鼠隨機分為6組，每組3只，并于造模后第3天起給予藥物干預，共用藥5周，第6周全部處死。

模型對照組:生理鹽水0.5 mL，2次/周×5周皮下注射;同時1 mL，1次/d×5周，灌胃。補腎方低劑量組:補腎方浸膏劑混懸液3 g/kg，1次/d×5周，灌胃。補腎方中劑量組:補腎方浸膏劑混懸液12 g/kg，1次/d×5周，灌胃。補腎方高劑量組:補腎方浸膏劑混懸液24 g/kg，1次/d×5周，灌胃。唑來膦酸鹽組:唑來膦酸鹽100 μg/kg，2次/周×5周皮下注射給藥。補腎方(低)+唑來膦酸鹽組:補腎方浸膏劑混懸液3 g/kg，1次/d×5周，灌胃。同時唑來膦酸鹽100 μg/kg，2次/周×5周皮下注射給藥。

1.4 觀察指標及方法

1)組織病理切片：將固定好的股骨組織取出，經(jīng)5%硝酸脫鈣3 d，并沖水4 h后用蘇木素染色15 min，淡氨水反藍10 min，伊紅染色1 min；再經(jīng)過乙醇沖洗、脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、烘干后顯微鏡下觀察。

2)Western-Blot法檢測OPG，RANKL，IL-6蛋白的表達：提取組織總蛋白，加入電泳裂解緩沖液，取20 g變性裂解蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉移至硝酸纖維素膜，經(jīng)封閉后，加入OPG，RANKL，IL-6相應一抗，后經(jīng)室溫下孵育、搖洗、AP標記的二抗孵育，顯色觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)收集及分析處理，計量資料以t檢驗比較，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組組織病理切片比較

正常組小鼠骨髓腔內(nèi)為正常的骨髓細胞，骨小梁和骨皮質是完好的，骨及骨髓造血組織未見明顯病理性改變，見圖1。模型組小鼠病理圖片顯示骨皮質表面大部分被腫瘤細胞侵蝕破壞，骨髓腔內(nèi)骨小梁被嚴重破壞，骨髓腔內(nèi)造血細胞部分壞死，結構模糊不清(+++)，見圖2。唑來膦酸組及補腎方中劑量、補腎方(低)+唑來膦酸鹽組小鼠病理：骨皮質完整結構清晰，骨髓腔內(nèi)骨小梁與造血細胞少量破壞(+)，見圖3。

圖1 正常組小鼠骨組織腫瘤細胞密度(HE染色，×200)

圖2 模型組小鼠骨組織腫瘤細胞密度(HE染色，×200)

圖3 補腎方中劑量組小鼠骨組織腫瘤細胞密度(HE染色，×200)

2.2 各組骨轉移部位OPG蛋白的表達比較

結果表明模型組轉移癌OPG的表達較低，補腎方中劑量及補腎方(低)+唑來膦酸鹽的OPG蛋白的表達增高，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；補腎方低劑量組、補腎方高劑量組、唑來膦酸鹽組OPG蛋白的表達與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果表明補腎方中劑量、補腎方(低)+唑來膦酸鹽上調OPG蛋白的表達，其他組無明顯作用，見表1。

表1 各組骨轉移部位OPG蛋白的表達

2.3 各組骨轉移部位RANKL蛋白的表達比較

結果表明模型組轉移癌RANKL的表達較高，補腎方高劑量組RANKL蛋白的表達降低，與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；補腎方中劑量組、唑來膦酸鹽組及補腎方(低)+唑來膦酸鹽組RANKL蛋白的表達降低，與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；補腎方低劑量組RANKL蛋白的表達與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果表明補腎方高劑量、補腎方中劑量、唑來膦酸鹽及補腎方(低)+唑來膦酸鹽下調RANKLE蛋白的表達，補腎方低劑量無明顯作用，見表2。

表2 各組骨轉移部位RANKL蛋白的表達

2.4 各組骨轉移部位IL-6蛋白的表達比較

結果表明模型組轉移癌IL-6的表達較高，補腎方中劑量組及補腎方高劑量組IL-6蛋白的表達降低，與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；唑來膦酸鹽組及補腎方(低)+唑來膦酸鹽組IL-6蛋白的表達降低，與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；補腎方低劑量組IL-6蛋白的表達與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果表明補腎方中劑量組、補腎方高劑量組、唑來膦酸鹽組及補腎方(低)+唑來膦酸鹽組下調IL-6蛋白的表達，補腎方低劑量無明顯作用，見表3。

表3 各組骨轉移部位IL-6蛋白的表達

3 討論

中醫(yī)學上“骨疽”“骨蝕”“骨瘤”等詞多用來描述惡性腫瘤骨轉移[7]。肺癌骨轉移多發(fā)生在疾病的晚期，主要表現(xiàn)在溶骨性骨破壞方面[8]。肺癌骨轉移患者體質差，病程綿長，多傷及腎臟，導致腎中精氣耗損，《外科樞要》記載：“若勞傷腎水，不能榮骨而為腫瘤……名為骨瘤，隨氣凝滯，皆因臟腑受傷，氣血和違?！盵9-10]中醫(yī)學認為腎藏精，主骨生髓。腎精虧虛，筋骨失養(yǎng)，腫瘤骨轉移的根本原因在于腎精虧虛、痰瘀阻絡，故而治療常以補腎養(yǎng)精、散結通絡解毒為主[11-12]。

正常生理情況下，成骨細胞引起的骨形成和破骨細胞引起的骨吸收，兩者共同維持骨的代謝平衡[13]。當發(fā)生腫瘤骨轉移時，骨骼細胞損傷、骨質被破壞，不僅導致大量鈣釋放至血，還會引起磷酸鹽沉積，血清堿性磷酸酶增高，最終形成高鈣血癥、高磷酸血癥[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用補腎方治療骨轉移可以延緩骨轉移進展，緩解癥狀，與中醫(yī)之“腎生髓”的理論相貼切[16]。補腎方中重用骨碎補、淫羊藿、女貞子、黃精等填精生髓，鱉甲、蜂房軟堅散結，干蟾皮、山慈菇解毒散結，自然銅、延胡索散結止痛，諸藥合用，補腎精，壯骨髓，散瘀結[17]。

RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)被認為是調節(jié)破骨細胞和骨吸收的重要因子[18]。OPG可抑制破骨細胞分化、抑制成熟破骨細胞活性、誘導成熟破骨細胞凋亡，RANKL能直接啟動破骨細胞前體細胞或破骨細胞細胞內(nèi)信號傳導過程，維持破骨細胞活性；破骨細胞表面的RANK是RANKL刺激破骨細胞分化、成熟的唯一靶受體；IL-6可誘導破骨細胞分化，從而促進腫瘤細胞的生長和溶骨性骨破壞[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)：補腎方中劑量、補腎方(低)+唑來膦酸鹽上調OPG蛋白的表達，其他組無明顯作用；補腎方高劑量、補腎方中劑量、唑來膦酸鹽及補腎方(低)+唑來膦酸鹽下調RANKLE蛋白的表達，補腎方低劑量無明顯作用；補腎方中劑量、補腎方高劑量、唑來膦酸鹽及補腎方(低)+唑來膦酸鹽下調IL-6蛋白的表達，補腎方低劑量無明顯作用。上述結果提示：補腎方可能通過增加OPG蛋白的表達，從而抑制破骨細胞活性，抑制肺腺癌細胞的骨轉移；同時，還可能通過抑制RANKL和IL-6的表達從而抑制腫瘤組織對骨質的溶骨性破壞。

綜上所述，中醫(yī)補腎法通過增加OPG蛋白的表達、抑制RANKL和IL-6的表達，最終達到抗腫瘤骨轉移的作用，值得臨床上進一步研究。