葡萄糖氧化酶協(xié)同抗生素抑菌效果的研究

◆作者：荊新堂 于東 陳寧波 芮法祥 杜正超

促生長(zhǎng)抗生素（AGP）是一類對(duì)致病菌、寄生蟲(chóng)等具有抑制和殺滅作用的藥物添加劑，被廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)和養(yǎng)殖業(yè)中，在提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)方面發(fā)揮了重要的作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于AGP的長(zhǎng)期使用，養(yǎng)殖環(huán)境中致病菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，各種混合感染導(dǎo)致的動(dòng)物病死率逐年上升，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。由于常規(guī)治療用抗生素使用量越來(lái)越大，食品中抗生素殘留出現(xiàn)的概率越來(lái)越高，尋找AGP的替代品成為畜牧行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)，低抗或無(wú)抗養(yǎng)殖成為當(dāng)前畜牧業(yè)發(fā)展的一大趨勢(shì)。

葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOX）是一種以FAD為輔基的黃素蛋白酶（圖1），能夠利用分子氧作為電子受體，催化β-D-葡萄糖氧化生成D-葡萄糖酸和過(guò)氧化氫（圖2）。作為一種綠色安全的添加劑，在化工、制藥、食品、飲料、臨床化學(xué)、生物技術(shù)等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。而在飼料添加劑領(lǐng)域，葡萄糖氧化酶以其無(wú)毒、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留的特點(diǎn)，成為近幾年來(lái)繼酸化劑、益生菌、植物提取物等之后的又一研究熱點(diǎn)。

圖1 葡萄糖氧化酶帶狀分子結(jié)構(gòu)

圖2 葡萄糖氧化酶的作用機(jī)理

當(dāng)前，葡萄糖氧化酶的研究報(bào)道主要集中于酶活檢測(cè)和養(yǎng)殖端的應(yīng)用效果驗(yàn)證上，對(duì)聯(lián)合抗生素進(jìn)行抑菌、減少抗生素的使用方面的研究較少，本試驗(yàn)從體外抑菌的角度，研究葡萄糖氧化酶、抗生素、葡萄糖三種組分在何種濃度下，對(duì)致病菌的抑制效果最好，以期為葡萄糖氧化酶在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水溶性葡萄糖氧化酶：酶活1000 U/g，濟(jì)南百斯杰生物工程有限公司；大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；替米考星、硫酸粘桿菌素、安普霉素、痢菌凈，濟(jì)南禽牧幫生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用牛津杯法（管碟法）對(duì)致病菌進(jìn)行抑菌圈的測(cè)定，采用液體培養(yǎng)鑒定OD600值的方法對(duì)致病菌進(jìn)行抑菌率的測(cè)定。

1.2.1 試驗(yàn)一：GOX對(duì)致病菌的抑制試驗(yàn)

配制濃度分別為200mg/L、300 mg/L、600mg/L的GOX溶液（含1%葡萄糖）待用。采用雙層平板進(jìn)行致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）菌液的涂布，即在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入15 mL LB瓊脂培養(yǎng)基封底，凝固后取0.4 mL濃度為108 CFU/mL菌液加入到100 mL LB瓊脂培養(yǎng)基（55～60℃）中混勻，后取6 mL加入到LB平板中。待平板凝固后，在培養(yǎng)基表面放置一個(gè)牛津杯，分別加入200μL的GOX溶液，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈大小。

1.2.2 試驗(yàn)二：抗生素+GOX在LB瓊脂培養(yǎng)基中的抑菌試驗(yàn)（測(cè)抑菌圈）

配制100 mg/L的抗生素（替米考星、硫酸粘桿菌素、安普霉素、痢菌凈）水溶液（含1%葡萄糖），分對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組加蒸餾水，試驗(yàn)組加GOX，分別制成試驗(yàn)樣液待用。采用雙層平板進(jìn)行致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）液的涂布（操作同試驗(yàn)一），待平板凝固后，在培養(yǎng)基表面放置一個(gè)牛津杯，分別加入200μL的試驗(yàn)樣液，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈大小。

1.2.3 試驗(yàn)三：抗生素+GOX在LB液體培養(yǎng)基中的抑菌試驗(yàn)（測(cè)OD600值）

將菌液（金黃色葡萄球菌）稀釋到106CFU/mL待用。試驗(yàn)分對(duì)照組和試驗(yàn)組1、2、3，取離心管分別加入菌液、抗生素（100 ppm替米考星）、GOX、葡萄糖（見(jiàn)表1），其中試驗(yàn)組1、2、3中的GOX又分為9個(gè)濃度梯度（0.1 U/mL～0.9 U/mL），再加入LB液體培養(yǎng)基，最后將每個(gè)管內(nèi)溶液的體積用蒸餾水補(bǔ)至相同。37℃，200 rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)，24 h后測(cè)溶液的OD600值，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=（陽(yáng)性對(duì)照-試驗(yàn)）/（陽(yáng)性對(duì)照-陰性對(duì)照）×100

1.2.4 試驗(yàn)四：抗生素+GOX抑菌試驗(yàn)中GOX和葡萄糖添加量的優(yōu)化試驗(yàn)

首先配制濃度為100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L的GOX溶液，再將每個(gè)濃度的GOX溶液中分別添加1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.1%、0.0625%的葡萄糖溶液，最后在每個(gè)溶液中添加一定量的抗生素（替米考星），使抗生素的終濃度為100mg/L，進(jìn)行致病菌（大腸桿菌）的培養(yǎng)，37℃，200 rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)，24 h后測(cè)溶液的OD值，計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果

2.1 GOX對(duì)致病菌的抑制試驗(yàn)

在溶液中有葡萄糖存在的情況下，添加不同劑量的GOX，均可以抑制致病菌的生長(zhǎng)。對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌三種致病菌的作用結(jié)果相同，即GOX的濃度越高，抑菌圈的直徑呈現(xiàn)出越大的趨勢(shì)（表2）。

表2 不同劑量GOX對(duì)腸道致病菌的抑菌效果

2.2 抗生素+GOX在LB瓊脂培養(yǎng)基中的抑菌試驗(yàn)

抑制金黃色葡萄球菌的試驗(yàn)：與對(duì)照組相比，抗生素為替米考星時(shí)，抑菌圈面積提高23%；抗生素為硫酸粘桿菌素時(shí)，抑菌圈面積提高40%；抑制大腸桿菌的試驗(yàn)：與對(duì)照組相比，抗生素為安普霉素時(shí)，抑菌圈面積提高32%；抗生素為痢菌凈時(shí)，抑菌圈面積提高27%（表3）。

表3 GOX對(duì)抗生素的協(xié)抗作用

2.3 抗生素+GOX在LB液體培養(yǎng)基中的抑菌試驗(yàn)

在同一試驗(yàn)組中，GOX濃度介于0.1～0.9 U/mL時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)組抑菌效果相差不大，基本維持在97%～98%；在不同的試驗(yàn)組中，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組在添加GOX之后，均體現(xiàn)出較好的抑菌效果，抑菌率比對(duì)照組提高了6.5%～8.0%，其中，以GOX+葡萄糖+替米考星的組合抑菌效果最好（圖3）。

2.4 抗生素+GOX抑菌試驗(yàn)中GOX和葡萄糖添加量的優(yōu)化試驗(yàn)

在抗生素（100mg/L替米考星）固定的條件下，隨著葡萄糖添加量的降低，GOX+抗生素抑菌效果有所下降，但降幅較小，從優(yōu)化試驗(yàn)的角度考慮，當(dāng)葡萄糖添加量為0.1%時(shí)，GOX仍然能夠發(fā)揮良好的抑菌效果。

隨著GOX濃度的降低，協(xié)抗抑菌作用有所下降，但降幅較小。當(dāng)GOX的濃度最小為50 mg/L時(shí)，仍有比較明顯的協(xié)抗抑菌效果（圖4）。

3 討論

3.1 GOX對(duì)致病菌的抑制作用

GOX是一種比較特殊的酶制劑，它不同于我們理解中的消化酶、非淀粉多糖酶。它的作用機(jī)理是通過(guò)葡萄糖的氧化消耗氧氣，同時(shí)產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。腸道中氧氣減少，創(chuàng)造有利于有益微生物生長(zhǎng)繁殖的無(wú)氧條件；過(guò)氧化氫雖不穩(wěn)定，但抗微生物起作用的濃度極低。有試驗(yàn)表明，大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)給予恒定濃度的過(guò)氧化氫（濃度0.02～0.05 mmol/L）時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)即受抑制，該濃度不傷害人皮膚的成纖細(xì)胞，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于現(xiàn)行過(guò)氧化氫消毒液。本試驗(yàn)中單獨(dú)添加GOX即能產(chǎn)生良好的抑菌效果，是由于GOX催化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而且過(guò)氧化氫不斷累積所致。GOX濃度越大，累積的過(guò)氧化氫越多，抑制效果越好，這與湯海鷗等（2015）的研究結(jié)果相一致。而在動(dòng)物腸道中，過(guò)氧化氫不會(huì)產(chǎn)生累積效果，更多的是從改善腸道微生物生長(zhǎng)環(huán)境入手，不會(huì)使致病菌產(chǎn)生耐藥性，不會(huì)產(chǎn)生殘留，更不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生副作用，是名副其實(shí)的綠色安全健康產(chǎn)品。

圖3 不同試驗(yàn)組的抑菌率對(duì)比

圖4 不同濃度葡萄糖及GOX的抑菌率對(duì)比

3.2 抗生素+GOX聯(lián)合使用對(duì)致病菌的抑制作用

由于飼用促生長(zhǎng)抗生素的長(zhǎng)期使用，養(yǎng)殖環(huán)境中致病菌的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，治療用抗生素的使用效果越來(lái)越差，尋找一種抗生素的替代物或增強(qiáng)劑來(lái)緩解致病菌耐藥性的問(wèn)題迫在眉睫。試驗(yàn)二和試驗(yàn)三從固態(tài)和液態(tài)兩個(gè)角度分別進(jìn)行抑菌圈和OD值的測(cè)定，試驗(yàn)所用致病菌包括金黃色葡萄糖菌（G+）和大腸桿菌（G-）兩種；所用的抗生素既有飼料禁抗前長(zhǎng)期在飼料中使用的硫酸粘桿菌素，又有養(yǎng)殖終端常用的替米考星、痢菌凈、安普霉素，整個(gè)試驗(yàn)涉及范圍廣，代表性強(qiáng)，全面驗(yàn)證了GOX在各種條件下的作用效果。GOX既可以作為一種抗生素抑菌增強(qiáng)劑，也可以單獨(dú)長(zhǎng)期使用，從不同的方位和角度維持動(dòng)物腸道健康，從而達(dá)到替抗、減抗、無(wú)抗的目的，是一種綠色、環(huán)保、無(wú)殘留、無(wú)害的飼料添加劑。

3.3 GOX和葡萄糖添加量的優(yōu)化試驗(yàn)

作為一種特殊的功能性添加劑，GOX作用的發(fā)揮依賴于葡萄糖的存在，葡萄糖添加量的大小直接影響到GOX抑菌功能的發(fā)揮。由于腸道是淀粉消化的主要場(chǎng)所，葡萄糖的含量較高，GOX與飼料一同飼喂動(dòng)物，可不考慮腸道中葡萄糖含量不足的問(wèn)題。但在體外試驗(yàn)中，葡萄糖的多少對(duì)于試驗(yàn)的成敗至關(guān)重要。試驗(yàn)三中的試驗(yàn)組1（替米考星+GOX）雖然未加葡萄糖，與對(duì)照組相比，抑菌率達(dá)到97%以上，是由于抗生素載體中含有部分葡萄糖（掩蓋替米考星的苦味）所致。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)GOX和葡萄糖添加量的優(yōu)化，既驗(yàn)證了葡萄糖在GOX協(xié)抗作用中的重要性，也驗(yàn)證了GOX協(xié)抗抑菌的最小添加量，為GOX在實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用提供了指導(dǎo)。

4 結(jié)論

GOX對(duì)不同致病菌均有抑制作用，添加量越高，抑菌效果越好。

GOX作為一種抑菌增強(qiáng)劑，可以提高抗生素的抑菌效果，減少抗生素的使用量。

參考文獻(xiàn)：（略）