一種測(cè)定福壽花浸膏中蝦青素含量的酶解-正相高效液相色譜法研究

◆作者：陳小兵 林勁冬，2 冼啟志 許雪磊 陶正國(guó)

蝦青素（3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素）是一種重要的類胡蘿卜素，在飼料中有極其重要的作用（翟興文等，2002）。天然來(lái)源的蝦青素大多是以脂肪酸酯的形式存在，如福壽花、雨生紅球藻、蝦殼所含的蝦青素基本上是以酯的形式存在，其中又包括蝦青素雙脂肪酸酯和蝦青素單脂肪酸酯。天然蝦青素在高效液相色譜測(cè)定前需要通過(guò)堿皂化或酶水解的方式進(jìn)行分解，其中皂化法被廣泛應(yīng)用于大多數(shù)羥基類胡蘿卜素分析，因?yàn)樗侨コ~綠素和脂質(zhì)的有效方法，也能夠幾乎完全地水解樣品中的羥基類胡蘿卜素酯，從而簡(jiǎn)化液相色譜圖。

然而，對(duì)于蝦青素而言，其分子中的羰基和羥基處于鄰位，在堿性條件下極易被氧化為蝦紅素和半蝦紅素（Yuan J P等，1999），并進(jìn)一步降解。氧化降解反應(yīng)往往導(dǎo)致蝦青素測(cè)定結(jié)果的較大偏差。降低皂化反應(yīng)中堿的濃度和溫度，有利于減少皂化過(guò)程中蝦青素的損失（陳興才，2005）。Yuan J P等（1999）的研究表明，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，0.4mol/L堿溶液在40℃下反應(yīng)1小時(shí)，幾乎可以完全皂化，其中約80%的產(chǎn)物為蝦青素，10%為金盞花紅素，其余產(chǎn)物主要為蝦紅素和半蝦紅素。當(dāng)堿濃度升高到2mol/L，溫度升高到60℃，反應(yīng)1小時(shí)之后，產(chǎn)物中蝦青素減少至20%以下，主要產(chǎn)物是蝦紅素和半蝦紅素。齊安翔等（2005）進(jìn)行了堿皂化法測(cè)定蝦青素含量的研究，難以獲得理想的測(cè)定結(jié)果。操作條件苛刻，結(jié)果的重復(fù)性難以保障。由于堿對(duì)蝦青素本身存在降解作用，對(duì)于同一樣品，采用低溫皂化法預(yù)處理測(cè)定蝦青素比酶解法測(cè)定的含量數(shù)據(jù)低得多，并且還隨著反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短的不同而不同（Lietz G等，1997）。而且低溫低堿皂化法耗時(shí)冗長(zhǎng)，條件苛刻，不是測(cè)定天然蝦青素的理想方法。

福壽花浸膏中所含的蝦青素多以蝦青素脂肪酸酯的形式存在，為了應(yīng)用液相色譜法準(zhǔn)確測(cè)定其蝦青素的含量，需要預(yù)先將蝦青素酯定量轉(zhuǎn)化為蝦青素。由于蝦青素在堿皂化過(guò)程中容易降解，所以國(guó)際上要求嚴(yán)格的天然蝦青素測(cè)定多采用膽固醇酯酶催化水解預(yù)處理結(jié)合高效液相色譜進(jìn)行。這種酶解-液相色譜法應(yīng)用到雨生紅球藻及其提取物中的蝦青素含量測(cè)定時(shí)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，得到廣泛的認(rèn)可。但膽固醇酯酶法檢測(cè)蝦青素的成本高，所以酶解法難以推廣應(yīng)用，至今仍未普及。

由于皂化法難以確保準(zhǔn)確性，膽固醇酯酶法又成本過(guò)高，所以，探索一種成本低，酶來(lái)源穩(wěn)定，重復(fù)性好，測(cè)定周期短的新的酶解方法，成為推廣高效液相色譜法準(zhǔn)確測(cè)定天然蝦青素酯樣品中蝦青素含量的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究比較一種商品化的南極假絲酵母脂肪酶和公認(rèn)的膽固醇酯酶在同等條件下進(jìn)行福壽花浸膏蝦青素酯的酶解反應(yīng)，建立一種采用商品化南極假絲酵母脂肪酶進(jìn)行天然蝦青素酯酶解測(cè)定的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

福壽花超臨界二氧化碳萃取浸膏，由廣州立達(dá)爾生物科技股份有限公司技術(shù)中心提供。反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素對(duì)照品，購(gòu)自Sigma-Aldrich，HPLC純度≥97%。南極假絲酵母脂肪酶，5U/mg，購(gòu)自Novozymes。膽固醇酯酶(源自熒光假單胞菌)，10U/mg，購(gòu)自Sigma-Aldrich。分析純?cè)噭喝u甲基氨基甲烷(TRIS)、丙酮、二氯甲烷、石油醚（60-90℃）、鹽酸、無(wú)水硫酸鈉，購(gòu)自西隴化工股份有限公司。色譜純?cè)噭赫和椤⒈?，?gòu)自西隴化工股份有限公司。氮?dú)?，?gòu)自Air Product公司。蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀島津LC-20A（配有二極管陣列檢測(cè)器），恒溫震蕩培養(yǎng)箱，充氮手套操作箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

在充氮操作箱內(nèi)，用電子分析天平精確稱量反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品約0.05 g（精確到0.000 1 g）到100 mL棕色容量瓶中，用10 mL二氯甲烷溶解，然后用正己烷/丙酮（86/14，v/v）混合溶劑定容至刻度，得到儲(chǔ)備溶液（含有蝦青素約0.5 mg/mL）。接著分別使用正己烷/丙酮（86/14，v/v）混合溶劑將儲(chǔ)備溶液定量稀釋2、4、8、16、32、64倍，所得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液供測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線使用。

1.3.2 色譜條件

流動(dòng)相由86∶14（v/v）的色譜純正己烷和丙酮組成。HPLC系統(tǒng)（島津LC-20A）配有粒度5.0μm硅膠填充色譜柱（4.6×250mm，安捷倫）和內(nèi)置柱溫恒溫箱，設(shè)定分析時(shí)的柱溫為35℃，流動(dòng)相流速為1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為470 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線確定

在所述色譜條件下測(cè)定各反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)峰面積，以峰面積(X)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(Y)為變量，采用線性回歸法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本實(shí)驗(yàn)中，9-順-蝦青素和13-順-蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)品僅用作色譜圖中蝦青素各順?lè)串悩?gòu)體定性使用，反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的濃度與峰面積響應(yīng)關(guān)系按11∶1計(jì)算，用反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的總面積計(jì)算蝦青素的總量。

1.4 南極假絲酵母脂肪酶與膽固醇酯酶對(duì)樣品的酶解處理

1.4.1 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液的配制

精確稱取三羥甲基氨基甲烷0.606 g至100 mL容量瓶，用75 mL蒸餾水溶解，再用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，然后用水定容至刻度，所得溶液計(jì)算濃度為0.05 mol/L。

1.4.2 南極假絲酵母脂肪酶溶液的配制

準(zhǔn)確稱取90 mg南極假絲酵母脂肪酶（5 U/mg），溶解到45 mL預(yù)先配制好的三羥甲基氨基甲烷水溶液中，配制成10 U/mL的酶液備用。

1.4.3 膽固醇酯酶溶液的配制

準(zhǔn)確稱取45 mg膽固醇酯酶（10 U/mg），溶解到45 mL預(yù)先配制好的三羥甲基氨基甲烷水溶液中，配制成10 U/mL的酶液備用。

1.4.4 福壽花浸膏樣品的酶解與處理

稱取福壽花浸膏約0.05 g（精確至0.000 1 g）至25 mL容量瓶，加丙酮20 mL后在常溫下超聲輔助提取10 min，冷卻后用丙酮定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確移取2 mL上述丙酮溶液至10 mL離心管，然后加入3 mL南極假絲酵母脂肪酶溶液（酶解反應(yīng)液中的脂肪酶濃度為6 U/mL），振搖30 s，得到酶解反應(yīng)液1#。

以相同的方法配制出另外7份南極假絲酵母脂肪酶的酶解反應(yīng)樣品2#-8#，各振搖30 s后，將8份樣品同時(shí)放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱，于37℃下震蕩反應(yīng)，并按編號(hào)依次在20min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、120 min取出，加入1 g無(wú)水硫酸鈉和3 mL石油醚終止反應(yīng)，激烈振搖30 s后，避光放置等待處理。

使用1.4.3所配制的膽固醇酯酶的溶液作為催化劑，依照相同的方法，制備8組酶解反應(yīng)液9#-16#，分 別 酶 解20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、120 min取出，即刻加入1 g無(wú)水硫酸鈉和3 mL石油醚終止反應(yīng)，激烈振搖30 s后，避光放置等待處理。

上述16組分別采用南極假絲酵母脂肪酶和膽固醇酯酶的反應(yīng)處理液隨后放入高速離心機(jī)以5000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min。離心完畢后，各自取上清液過(guò)濾膜后置于進(jìn)樣瓶中避光存放，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.5 正相高效液相色譜法測(cè)定蝦青素含量

高效液相色譜儀在1.5 mL/min的恒定流速下工作。將上述16組進(jìn)樣瓶置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，按1#-16#的順序分別自動(dòng)進(jìn)樣20μL，色譜工作站采集各樣品470 nm下的DAD數(shù)據(jù)并積分，以反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的峰面積之和計(jì)算各蝦青素樣品溶液的濃度并依據(jù)福壽花浸膏樣品的重量及稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化為福壽花浸膏樣品的蝦青素含量。

1.6 計(jì)算

樣品稱重量為m(單位為g)，經(jīng)上述過(guò)程制備上機(jī)溶液，在液相譜圖中積分獲得全反式蝦青素的面積X1，9-順-蝦青素的面積X2和13-順-蝦青素的面積X3，以三者之和作為蝦青素色譜峰的總面積X。首先通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上機(jī)溶液中蝦青素的濃度Y（mg/mL），再通過(guò)稀釋倍率及單位轉(zhuǎn)換關(guān)系計(jì)算浸膏樣品中的蝦青素含量C(%)，計(jì)算公式為：

1.7 南極假絲酵母脂肪酶酶解后液相色譜測(cè)定蝦青素的重復(fù)性

以60 min酶解時(shí)間為時(shí)間基準(zhǔn)，對(duì)采用南極假絲酵母脂肪酶溶液酶解同一個(gè)福壽花浸膏樣品進(jìn)而采用正相高效液相色譜測(cè)定蝦青素含量的結(jié)果重復(fù)性進(jìn)行了研究。

稱取同一福壽花浸膏樣品6份各約0.05 g（精確至0.000 1 g）至獨(dú)立的6個(gè)25 mL容量瓶，編號(hào)R1#-R6#。分別加丙酮20 mL后在常溫下超聲輔助提取10 min，冷卻后用丙酮定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確移取2 ml R1#-R6#丙酮溶液至6個(gè)編號(hào)的10 mL離心管，然后各加入3 mL南極假絲酵母脂肪酶溶液（酶解反應(yīng)液中的脂肪酶濃度為6 U/mL），振搖30 s，得到酶解反應(yīng)液。將R1#-R6#反應(yīng)液放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱，于37℃下震蕩反應(yīng)60 min同時(shí)取出，立刻分別加入1 g無(wú)水硫酸鈉和3 mL石油醚終止反應(yīng)，激烈振搖30 s后，同時(shí)放入高速離心機(jī)以5000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min。離心完畢后，各自取上清液過(guò)濾膜后置于進(jìn)樣瓶，等待進(jìn)樣樣品R1#-R6#，進(jìn)樣分析。高效液相色譜儀在1.5 mL/min的恒定流速下工作。分別自動(dòng)進(jìn)樣20μL，色譜工作站采集各樣品470 nm下的DAD數(shù)據(jù)并積分，以反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的峰面積之和計(jì)算各蝦青素樣品溶液的濃度并依據(jù)福壽花浸膏樣品的重量及稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化為福壽花浸膏樣品的蝦青素含量。

表1 同一福壽花浸膏樣品在兩種相同濃度酶液中的酶解數(shù)據(jù)＊

對(duì)上述6組獨(dú)立測(cè)定的樣品的蝦青素含量的計(jì)算值、平均值和平均偏差進(jìn)行計(jì)算，判斷該檢測(cè)方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在進(jìn)樣后，各反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度數(shù)據(jù)（mg/mL）和積分面積擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3.95061×10-8X+1.57276×10-4。相關(guān)系數(shù)R2為0.998，顯示在設(shè)定的樣品濃度范圍內(nèi)反式蝦青素的濃度與峰面積響應(yīng)值具有良好的線性關(guān)系。高效液相色譜的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 酶解完全所需時(shí)間分析

在測(cè)定天然蝦青素酯樣品中蝦青素含量的高效液相色譜法檢測(cè)中，蝦青素酯的酶解游離轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵步驟。只有當(dāng)蝦青素酯能夠接近定量地轉(zhuǎn)化為游離蝦青素，而游離蝦青素又能保持穩(wěn)定，才有可能準(zhǔn)確測(cè)定原樣品中蝦青素的真實(shí)含量。蝦青素酯的酶解反應(yīng)過(guò)程包括蝦青素二脂肪酸酯酶解轉(zhuǎn)化為蝦青素單脂肪酸酯和蝦青素單脂肪酸酯酶解轉(zhuǎn)化為游離的蝦青素。最終，可以通過(guò)液相色譜圖（如圖3-圖5）觀察到蝦青素二脂肪酸酯及蝦青素單酯對(duì)應(yīng)的色譜峰全部轉(zhuǎn)化為游離蝦青素（主要包括全反式蝦青素、9-順-蝦青素和13-順-蝦青素），此時(shí)便達(dá)到轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最大轉(zhuǎn)化率。以達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率時(shí)游離蝦青素（包括全反式蝦青素、9-順-蝦青素和13-順-蝦青素）的峰面積可推算原樣品中蝦青素的總含量。

圖2 樣品在兩種酶中酶解過(guò)程的蝦青素測(cè)定值曲線

圖3 蝦青素對(duì)照品的高效液相色譜圖

在本實(shí)驗(yàn)中，南極假絲脂肪酶和膽固醇酯酶都在酶活濃度6 U/mL的條件下對(duì)蝦青素酯（福壽花浸膏）樣品進(jìn)行酶解處理。

本實(shí)驗(yàn)中不同酶解時(shí)間的蝦青素轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，南極假絲酵母脂肪酶和膽固醇酯酶都能夠很好地將天然蝦青素酯酶解為游離態(tài)的蝦青素，而且完成酶解所需要的時(shí)間都不超過(guò)60 min。膽固醇酯酶較南極假絲酵母脂肪酶轉(zhuǎn)化速度更快，大約在50 min內(nèi)即轉(zhuǎn)化完全，南極假絲酵母脂肪酶在60 min轉(zhuǎn)化完全（如圖2）。其后，70 min和80 min的酶解保持穩(wěn)定。為了驗(yàn)證游離蝦青素在該體系中的穩(wěn)定性，我們對(duì)兩種酶各進(jìn)行了一次120 min的酶解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，無(wú)論是膽固醇酯酶還是南極假絲酵母脂肪酶，都在延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中保持了穩(wěn)定性。證明在酶解完全后，在常溫避光的保存條件下，并無(wú)明顯的逆向反應(yīng)或?qū)е挛r青素降解的因素存在。

圖4 福壽花浸膏樣品的高效液相色譜圖

圖5 福壽花浸膏在南極假絲酵母脂肪酶中酶解過(guò)程的液相色譜圖

2.3 重復(fù)性

相同條件下進(jìn)行的6組獨(dú)立蝦青素含量測(cè)定數(shù)據(jù)記錄在表2中，6次平行測(cè)定所得樣品蝦青素含量算術(shù)平均值為9.199%，6次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.02372%。

表2 南極假絲酵母脂肪酶酶解-液相色譜法測(cè)定福壽花浸膏中蝦青素含量的重復(fù)性研究（n=6）

由此可見(jiàn)，南極假絲酵母脂肪酶酶解結(jié)合高效液相色譜測(cè)定的方法在測(cè)定蝦青素含量在10%左右的福壽花浸膏樣品時(shí)，具有很高的重復(fù)性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，用商品化的南極假絲酵母脂肪酶可以徹底地進(jìn)行蝦青素酯的酶解，并且酶解不會(huì)像強(qiáng)堿皂化法那樣導(dǎo)致蝦青素的降解。盡管南極假絲酵母脂肪酶的酶解速度較膽固醇酯酶略慢，但仍然可以控制在60 min左右完成酶解，其效率比一般的低溫堿皂化方法高得多。而且，待測(cè)和已預(yù)處理的樣品都無(wú)需冷藏和充氮處理，僅需正常避光存放即可，大幅度降低了檢測(cè)的難度。更重要的是，南極假絲酵母脂肪酶酶解-正相色譜法具有優(yōu)異的重復(fù)性，所測(cè)數(shù)據(jù)可信度高。由于南極假絲酵母脂肪酶已經(jīng)商品化，價(jià)格相對(duì)膽固醇酯酶低得多，所以，南極假絲酵母脂肪酶酶解-正相高效液相色譜法有望廣泛應(yīng)用到雨生紅球藻、蝦殼、福壽花等天然蝦青素原料和產(chǎn)品的蝦青素含量測(cè)定領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：(略)