超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蔬菜中阿維菌素和氟吡菌酰胺的殘留

陳麗霞 許麗建 陳歆 彭黎旭

摘? 要：為建立同時測定蔬菜中阿維菌素和氟吡菌酰胺殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，采用乙腈高速勻漿提取蔬菜樣品中的阿維菌素和氟吡菌酰胺，利用無水硫酸鎂和PSA吸附劑進行凈化，在UPLC-MS/MS的正離子電離和多反應離子監(jiān)測模式下進行測定。結(jié)果表明，阿維菌素和氟吡菌酰胺的檢出限分別為1.0、0.2 ?g/kg;在0.005～0.200 mg/L濃度范圍內(nèi)，其線性相關系數(shù)均大于0.999。阿維菌素和氟吡菌酰胺在3個試驗水平（0.01、0.02和1.0 mg/kg）的添加回收率分別為83%～106%和90%～108%，相對標準偏差分別在0.5%～5.2%和1.2%～8.4%。本方法前處理過程快速簡單，儀器分析靈敏度好，方法準確度高，可用于蔬菜樣品中阿維菌素和氟吡菌酰胺農(nóng)藥殘留量的檢測分析。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;蔬菜;阿維菌素;氟吡菌酰胺;殘留

中圖分類號：S481.8? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： To determine the residues of abamectin and fluopyram in vegetable samples， a method was established using the ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The vegetable samples were extracted with acetonitrile and purified with MgSO4 and PSA adsorbents. The target compounds were separated by a C18 UPLC column， then detected by electro-spray ionization （ESI+） and multiple reaction monitoring （MRM） mode. Quantification was performed by peak area external standard methods using matrix-matched calibration curves. In the range of 0.005 to 0.200 mg/L with good linear relationships， the correlation coefficients were better than 0.999. The limit of detection （LOD） of abamectin and fluopyram was 1.0 and 0.2 ?g/kg， respectively. At 0.01 to 1.0 mg/kg spiked levels for vegetable samples， the recovery of abamectin was between 83% and 106%， and the relative standard deviation （RSD） was in range of 0.5% to 5.2%; the recovery of fluopyram was between 90% and 108%， and the relative standard deviation （RSD） was in range of 1.2% to 8.4%. This method is simple， quick， accurate， and could be applied to the determination of the four pesticides residues in vegetable samples.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; vegetable; abamectin; fluopyram; residue

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.034

阿維菌素（abamectin）是一種大環(huán)內(nèi)酯類廣譜殺菌劑，主要從鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，對昆蟲和螨類具有較好的觸殺和胃毒作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用較廣[1-3]。氟吡菌酰胺（fluopyram）是一種新型的吡啶基乙基苯甲酰胺類殺線蟲劑，可抑制琥珀酸脫氫酶活性，并阻斷電子傳遞，實現(xiàn)防治病原菌或抑制其生長[4-6]。將阿維菌素和氟吡菌酰胺混合使用，可產(chǎn)生一定的協(xié)同作用，近年來被廣泛的用于各種蔬菜根結(jié)線蟲的防治[7-8]。由于阿維菌素為非內(nèi)吸性農(nóng)藥而氟吡菌酰胺為內(nèi)吸性農(nóng)藥，二者在灌根施用后在作物中的殘留量極低，迫切需要發(fā)展一種快速、靈敏、同時測定2種農(nóng)藥殘留的分析方法。

目前，阿維菌素的殘留檢測方法多使用高效液相色譜-紫外/熒光檢測法[9-10]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]及酶聯(lián)免疫法[14]等;氟吡菌酰胺的分析方法主要采用傳統(tǒng)的抗體免疫法[15]、氣相色譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16-17]，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法報道較少。有關同時測定農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素和氟吡菌酰胺殘留的方法尚未見報道。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蔬菜樣品中阿維菌素和氟吡菌酰胺的殘留量，為開展2種殺蟲劑的市場監(jiān)測、保障蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 黃瓜、西紅柿、茄子、辣椒、白蘿卜等樣品均購自?？诒镜厥袌?。

阿維菌素（B1a）標準品（1000 ?g/mL），天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心;氟吡菌酰胺標準品（純度>99%），Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇均為色譜純，美國Fisher Scientific公司;氯化鈉和無水硫酸鎂均為分析純，廣州化學試劑廠;PSA吸附劑（乙二胺-N-丙基硅烷）為分析純，安譜儀器（上海）有限公司。水為超純水。

1.1.2? 儀器與設備? Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀，美國Waters公司;AB 4500三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司;PL303電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司;ULTRA-TURRAX T25 digital高速勻漿機，德國IKA公司;GL-10C高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品的提取? 采用改進的QuEChERS方法[18]對蔬菜樣品中的阿維菌素和氟吡菌酰胺進行提取。首先準確稱取蔬菜樣品（10.0±0.1）g，置于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈溶劑進行提取，在15000 r/min轉(zhuǎn)速下高速勻漿1 min，使樣品中目標物被充分提取;加入氯化鈉2～3 g，繼續(xù)在15000 r/min轉(zhuǎn)速下高速勻漿1 min，通過鹽析作用去除樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì);將離心管在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，使液體和固體相完全分離，同時使有機相與水相分層，取上層乙腈相溶液待凈化。

1.2.2? 樣品的凈化? ?在10 mL離心管中預先加入100 mg的無水硫酸鎂和100 mg的PSA吸附劑，準確吸取5.0 mL乙腈相溶液，加入離心管劇烈振蕩2 min，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液2.0 mL，過0.22 μm有機相微膜，待儀器分析。

1.2.3? 儀器分析條件? 色譜條件：選擇ACQUITY UPLC?BEH C18液相色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）對樣品進行分離，設置柱溫為35 ℃。流動相為乙腈（A）和0.05%乙酸銨水溶液（B），流速為0.25 mL/min，以梯度洗脫模式對目標物進行洗脫，并通過預實驗對梯度模式進行優(yōu)化，確保阿維菌素和氟吡菌酰胺得到良好分離。

質(zhì)譜條件：選擇三重四級桿質(zhì)譜電噴霧正離子掃描和多反應監(jiān)測模式，主要的工作條件包括噴霧電壓5500 kV、霧化氣壓力379.225 kPa、毛細管溫度600 ℃。同時檢測阿維菌素和氟吡菌酰胺，其中阿維菌素的定量和定性離子對分別為m/z 890.5/305.2和890.5/567.2，碰撞能量為37/20 V，去簇電壓為82 V;氟吡菌酰胺的定量和定性離子對分別為m/z 397.1/173.0和397.1/208.0，碰撞能量為40/31 V，去簇電壓為87 V。

1.2.4? 標準溶液的配制及標準曲線的繪制? ?阿維菌素直接使用1000 ?g/mL的標準儲備溶液，氟吡菌酰胺使用甲醇配制1000 ?g/mL標準儲備溶液，并分別吸取1 mL的阿維菌素和氟吡菌酰胺儲備溶液，使用甲醇稀釋準確定容至100 mL，配制得到2種目標物的10 ?g/mL混合標準工作液。在樣品測定時，分別使用蔬菜樣品的空白提取液逐級稀釋配制系列基質(zhì)標準溶液，濃度分別為0.005、0.02、0.05、0.20、0.50 ?g/mL。以進樣標準溶液中目標物的濃度（?g/mL）作為橫坐標，以定量離子的峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5? 基質(zhì)效應? 為評價不同蔬菜基質(zhì)對阿維菌素和氟吡菌酰胺定量的基質(zhì)效應，分別以0.05 ?g/mL的基質(zhì)標準和純?nèi)軇藴嗜芤荷蠙C測定，記錄測定結(jié)果并分析不同蔬菜的績效效應。使用公式（1）計算樣品的基質(zhì)效應[19]，并對其進行評價。

蔬菜基質(zhì)效應=蔬菜基質(zhì)標準溶液響應值/純?nèi)軇藴嗜芤喉憫怠?00%? ? ? ? ? ? ?（1）

2? 結(jié)果與分析

2.1? 提取條件的優(yōu)化

分別測試了100 mg的3種不同吸附劑（弗羅里硅土、C18和PSA）對黃瓜、西紅柿、茄子、辣椒、白蘿卜樣品中目標物質(zhì)的凈化能力，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，弗羅里硅土吸附劑對阿維菌素存在較強的吸附，其回收率僅為54%～64%，不能滿足分析的需求;PSA和C18粉末對阿維菌素和氟吡菌酰胺均可以取得較好的凈化效果，回收率均大于80%，可滿足分析的需求。由于PSA粉末成本較低，因此在后續(xù)試驗中選擇PSA粉末進行樣品凈化。

2.2? 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用多反應監(jiān)測模式進行檢測，分別以0.5 ?g/mL的阿維菌素和氟吡菌酰胺標準溶液直接注入電噴霧離子源中，優(yōu)化其質(zhì)譜條件。在正離子檢測方式下進行一級質(zhì)譜分析，分別得到阿維菌素和氟吡菌酰胺穩(wěn)定且豐度高的母離子碎片。對比了阿維菌素分別為加氫、鈉和銨的母離子，發(fā)現(xiàn)加銨母離子的信號強度比其他2種模式提高了100倍以上，因此選擇[M+NH4]+作為阿維菌素的母離子，其m/z為890.5;氟吡菌酰胺的加氫母離子具有良好的靈敏度，選擇[M+H]+作為氟吡菌酰胺的母離子，其m/z為397.1。以母離子作為目標碎片，優(yōu)化質(zhì)譜的去簇電壓，確定阿維菌素和氟吡菌酰胺的去簇電壓分別為82.1、87.0 V。分析母離子的二級質(zhì)譜碎片，得到二級質(zhì)譜碎片的全譜信息，選擇信號強度最高的兩個離子分別作為定量和定性離子，并進一步儀器的碰撞電壓。方法的具體質(zhì)譜條件見表1，分別選擇阿維菌素和氟吡菌酰胺的信號最強碎片離子m/z 305.2和m/z 173.0作為方法的定量離子。

2.3? 色譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜檢測器具有多通道模式，可以實現(xiàn)分析目標物的良好分離。因此，在色譜條件中重點考慮提高阿維菌素和氟吡菌酰胺的分析靈敏度。考慮到阿維菌素在質(zhì)譜條件下的母離子為加銨模式，因此在流動相中加入0.05%乙酸銨（V/V），可提高阿維菌素的分析靈敏度5倍左右，同時對于氟吡菌酰胺的分析靈敏度沒有顯著影響。選擇乙腈（A）和0.05%乙酸銨水溶液（B）作為流動相，通過調(diào)整梯度洗脫中2種流動相的比例，確保阿維菌素和氟吡菌酰胺的快速流出，同時具有良好的分離度。最終確定的洗脫程序為：0～1.0 min，25% B;1.0～4.5 min，60% A;4.5～ 5.5 min，25% A。在該條件下，阿維菌素和氟吡菌酰胺的保留時間分別為3.50 min和2.84 min左右，可在實現(xiàn)快速檢測的同時獲得良好的檢測效果。其中，蔬菜樣品（黃瓜）的典型色譜圖見圖2。

2.4? 基質(zhì)效應

分別檢測了黃瓜、西紅柿和茄子這3種不同蔬菜樣品基質(zhì)對阿維菌素和氟吡菌酰胺的基質(zhì)效應，結(jié)果見圖3。根據(jù)結(jié)果，基質(zhì)效應分別為84%～ 92%和96%～107%，說明基質(zhì)效應對樣品定量存在一定影響。為去除蔬菜樣品在阿維菌素和氟吡菌酰胺測定過程中的基質(zhì)效應，在測定實際樣品時，均采用對應樣品的空白溶液配制基質(zhì)標準，并繪制標準曲線對目標物進行定量。

2.5? 方法的線性范圍和檢出限

阿維菌素和氟吡菌酰胺在黃瓜、西紅柿和茄子3種蔬菜樣品基質(zhì)標準的線性回歸方程和相關系數(shù)見表2，方法的檢出限（LOD，S/N=10）分別為1.0、0.2 ?g/kg。我國食品質(zhì)量安全國家標準GB 2763—2019[18]中規(guī)定蔬菜樣品中阿維菌素最大殘留限量值最低為0.01 mg/kg（西葫蘆），氟吡菌酰胺的臨時最大殘留限量值最低為0.01 mg/kg（蘆筍），本方法可滿足其檢測分析的需求。

2.6? 回收率與精密度

分別在黃瓜、西紅柿和茄子樣品中添加0.01、0.02、1.0 mg/kg的阿維菌素和氟吡菌酰胺，每個處理重復5次，按照樣品的前處理方法進行提取和凈化，根據(jù)檢測分析結(jié)果計算方法的添加回收率與相對標準偏差，結(jié)果見表3。我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》中規(guī)定，添加水平在0.01、0.02、1.0 mg/kg時，回收率應分別在60%～120%、70%～120%和70%～110%，相對標準偏差分別在30%、20%和10%以內(nèi)[19]。本研究中，在0.01、0.02、1.0 mg/kg 3個濃度水平，阿維菌素和氟吡菌酰胺的添加回收率和相對標準偏差均滿足要求。

2.7? 實際樣品檢測

在?？诒镜厥袌龀槿〉狞S瓜、西紅柿、茄子、辣椒、白蘿卜共5種蔬菜樣品，每種各40個，利用本方法進行檢測，所有樣品均配制基質(zhì)標準進行定量分析。結(jié)果表明，所抽取的蔬菜樣品均未檢出阿維菌素和氟吡菌酰胺。本方法具有良好的靈敏度和的重現(xiàn)性，可用于滿足市場樣品監(jiān)測的需求。

3? 討論

3.1? 阿維菌素和氟吡菌酰胺質(zhì)譜碎片的選擇

阿維菌素是一種十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物生物農(nóng)藥，其分子結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基。質(zhì)譜ESI離子源屬于一種軟電離源，常規(guī)的化學分子在離子源正離子模式下有加氫、加鈉和加銨3種模式。由于阿維菌素分子量較大，并且含有大量的羥基，其加鈉和加銨的信號大于加氫的信號，因此現(xiàn)有報道通常選擇加鈉和加銨離子作為檢測的母離子[20]。但是鈉離子不易揮發(fā)，容易對質(zhì)譜造成污染，因此本研究在流動相中加入乙酸銨，保證了目標物形成穩(wěn)定的母離子，并進一步激發(fā)獲得子離子，提高了阿維菌素檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。與阿維菌素相比，氟吡菌酰胺分子量相對較小，在ESI離子源正離子模式下加氫峰信號穩(wěn)定、靈敏，因此選擇其加氫峰進行分析。

3.2? 阿維菌素和氟吡菌酰胺在質(zhì)譜中的基質(zhì)效應

串聯(lián)質(zhì)譜在復雜樣品的農(nóng)藥殘留分析時容易受到基質(zhì)效應的干擾，對結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究針對可能使用阿維菌素和氟吡菌酰胺防治根結(jié)線蟲的作物，如黃瓜、西紅柿、茄子，其基質(zhì)中含雜質(zhì)較少。同時，本研究建立的方法通過PSA和C18粉末對樣品中極性和非極性雜質(zhì)進行凈化，均可以有效降低不同樣品中雜質(zhì)的影響。根據(jù)結(jié)果，阿維菌素和氟吡菌酰胺的基質(zhì)效應分別為84%～92%和96%～107%，方法的回收率和RSD均滿足檢測要求[19]，可很好的滿足樣品中阿維菌素和氟吡菌酰胺殘留量的檢測分析要求。

3.3? 阿維菌素和氟吡菌酰胺的檢測靈敏度

阿維菌素和氟吡菌酰胺混用防治蔬菜根結(jié)線蟲，近年來在生產(chǎn)中廣泛使用，其可能的殘留為蔬菜帶來潛在的安全風險。其中阿維菌素為非內(nèi)吸性農(nóng)藥，并且阿維菌素的半衰期較短，在灌根的施藥方式下，植株果實不直接接觸藥劑，因此阿維菌素在蔬菜中殘留量極小[21]。氟吡菌酰胺則為內(nèi)吸傳導活性的殺菌劑，因此其在灌根使用后可能在植株果實中殘留。我國食品安全國家標準中規(guī)定，阿維菌素和氟吡菌酰胺在蔬菜中的最大殘留限量最低值均為0.01 mg/kg，因此阿維菌素和氟吡菌酰胺的檢測方法需要極高的靈敏度。本研究建立的分析方法中，阿維菌素和氟吡菌酰胺的檢出限分別達到1.0、0.2 ?g/kg，可以很好的滿足檢測的需求。

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責任編輯：崔麗虹