龍眼DlZAT10基因克隆與植物超表達載體構(gòu)建

李琳 丁峰 潘介春 彭宏祥 張樹偉 何新華 徐炯志 黃幸 王金英 王穎 李浩然

摘? 要：以龍眼成熟葉片為材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析得到龍眼ZAT10基因全長序列，命名為DlZAT10（GenBank登陸號：MT117769），進一步設(shè)計特異引物對其開放閱讀框（ORF）全長序列進行克隆和生物信息學(xué)分析。DlZAT10基因?qū)儆贑2H2鋅指蛋白家族的C1-2i亞家族，ORF長度為738 bp，編碼245個氨基酸，無內(nèi)含子，有2個典型的C2H2結(jié)合位點。該蛋白屬于非跨膜親水蛋白，預(yù)測定位于細胞核，存在40個氨基酸磷酸化位點。其二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲，以及α-螺旋和β-折疊構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果高度一致。同源基因進化樹分析表明，該基因與柑橘和阿月渾子親緣關(guān)系最近。同時成功構(gòu)建了植物超表達載體PBI121- DlZAT10，為DlZAT10基因功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：龍眼;DlZAT10;基因克隆;脅迫

中圖分類號：S667.2? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： Using the mature leaves of longan as the materials， the full-length sequence of the ZAT10， named DlZAT10 （GenBankID： MT117769） in the longan transcriptome was obtained by transcriptome sequencing and bioinformatics analysis. Furthermore， specific primers were designed for cloning and bioinformatics analysis of the full-length sequence of its open reading frame （ORF）. DlZAT10 belonged to the C1-2i subfamily of the C2H2 zinc finger protein family. The ORF sequence was 738 bp in length， encoded 245 amino acids with two typical C2H2 binding sites of C2H2. This protein was non-transmembrane hydrophilic and predicted to be located in the nucleus with 40 amino acid phosphorylation sites. Its secondary structure was mainly composed of random coils， as well as α-helix and β-sheet. The predicted results of the secondary structure and tertiary structure were highly consistent. Phylogenetic tree analysis of the homologous gene indicated that the gene was most closely related to citrus and pistachio. At the same time， the plant overexpression vector pBI121-DlZAT10 was successfully constructed， which would provide basis for the in-depth study of the function of DlZAT10 gene.

Keywords： longan; DlZAT10; gene cloning; stress

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.005

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）屬于無患子科龍眼屬，是我國重要亞熱帶木本果樹之一，中國龍眼種植面積約占世界的59%，李時珍《本草綱目》中有“食品以荔枝為貴，而資益則龍眼為良”，其果實具有益氣、安神、滋膚之功效。但生產(chǎn)上龍眼常有“大小年”或隔年開花結(jié)果的現(xiàn)象[1]，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量與經(jīng)濟效益。以往生產(chǎn)經(jīng)驗表明非生物脅迫（如干旱、低溫等）能促進龍眼成花，而目前關(guān)于龍眼非生物脅迫耐受和誘導(dǎo)成花的分子機制尚未闡明。

鋅指蛋白（zinc-finger protein， ZFP）是轉(zhuǎn)錄因子的一種，因其具有指狀結(jié)構(gòu)且能結(jié)合鋅而得名[2]。根據(jù)鋅指蛋白在指狀二級結(jié)構(gòu)中與鋅離子結(jié)合的半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)量及順序的不同，可將其分為九大類：C2H2、C8、C6、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4、C4HC3和CCCH（C代表半胱氨酸，H代表組氨酸），其中C2H2型（Cys2 His2）是真核生物基因組中含量最多的鋅指蛋白，也是目前研究較為廣泛的一類。Takatsuji等[3]在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)了第一個植物特有的C2H2鋅指蛋白，該轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中有176個成員，在水稻中有189個成員[4]，在煙草中有118個成員[5]，植物C2H2型鋅指蛋白具有2個獨特的結(jié)構(gòu)：一是相鄰2個鋅指之間的氨基酸序列數(shù)目較多且種類變化大;二是與DNA結(jié)合處存在一段高度保守的氨基酸序列QALGGH，該序列為植物C2H2鋅指蛋白特有[6]。

自然界的植物在生長發(fā)育過程中，常遭受干旱、鹽堿、高溫、霜凍等各種非生物脅迫，其中干旱對植物的影響在所有非生物脅迫中占據(jù)首位。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)被認(rèn)為是植物響應(yīng)和適應(yīng)脅迫條件最重要的方法之一，在此過程中，轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵作用，可通過調(diào)控下游脅迫響應(yīng)基因使植株體內(nèi)其它相關(guān)基因被誘導(dǎo)或抑制，從而對逆境作出反應(yīng)[7]。其中，C2H2鋅指蛋白可通過與DNA、RNA或與蛋白質(zhì)相互作用以及自身結(jié)合在植物形態(tài)發(fā)生、生長發(fā)育、轉(zhuǎn)錄激活和逆境脅迫等方面發(fā)揮重要作用[8]。如C2H2 型鋅指蛋白的C1亞家族在擬南芥不同發(fā)育階段的防御及脅迫響應(yīng)中起著重要的作用。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并通過RT-PCR法從龍眼中克隆到一個C2H2型鋅指蛋白家族基因，命名為DlZAT10，以此轉(zhuǎn)錄因子為研究對象，采用生物信息學(xué)方法對其進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)等進行分析，為今后龍眼ZAT10基因的功能研究打下一定基礎(chǔ)，也為非生物脅迫促進龍眼成花的分子調(diào)控機制研究做一定的鋪墊。

1? 材料與方法

1.1? 材料

取樣地址為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院基地龍眼園，土壤為粘性赤紅壤土，pH 4.45～5.02，取樣樹體為長勢良好并在成花期進行干旱處理的8年生龍眼樹，選擇生長良好末次梢頂端下第三張復(fù)葉的中部成熟葉作為樣品，采后用紙擦去葉片表面灰塵，迅速裝袋標(biāo)記放入液氮內(nèi)保存。

主要試劑：多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、ExTaq?、rTaq?、dNTPs、DNA Marker（2000）、SolutionI、克隆載體PMD18-T、5X In-Fusion HD Enzyme Premix等均購于TaKaRa;大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購于廣西南寧國拓生物科技有限公司;植物雙元表達載體PBI121由本實驗室保存;限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;氨芐青霉素（Ampicillin）和卡那霉素（Kanamycin）購自廣州生物工程有限公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。在生工生物工程（上海）股份有限公司進行PCR引物合成，在武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，通過基因轉(zhuǎn)錄組三代測序以及對比龍眼基因組數(shù)據(jù)庫通過生物信息學(xué)分析得到龍眼轉(zhuǎn)錄組DlZAT10基因序列全長。

1.2? 方法

1.2.1? 龍眼葉片總RNA提取及PCR擴增? 對研缽、研磨棒及稱量勺進行充分消毒滅菌，取50～100 g新鮮樣品葉片加液氮充分研磨，提取龍眼葉片中的總RNA，用紫外分光光度計檢測所提RNA的濃度和純度，記錄OD260/280、OD260/230的比值和濃度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，檢測正確后?80 ℃保存?zhèn)溆谩＠肞rimer Premier 5.0軟件根據(jù)前期得到的龍眼轉(zhuǎn)錄組DlZAT10基因序列全長設(shè)計該基因的上下游引物（表1 c-DlZAT10），長度一般為20～25 bp，選擇無發(fā)卡結(jié)構(gòu)、無引物二聚體結(jié)構(gòu)、無錯配的引物，得到引物后以cDNA為模板通過巢式PCR技術(shù)擴增目的基因全長。

1.2.2? DlZAT10基因的克隆與測序? DlZAT10基因PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰，用膠回收試劑盒回收目的基因片段，回收檢測后將目的片段與載體PMD18-T在金屬浴內(nèi)恒溫16 ℃連接12～24 h，稀釋連接液并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，搖床擴繁后吸取菌液120 μL涂于含有氨芐青霉素（100 mg/L）的LB（Luria- Bertani）固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)15～24 h后挑選陽性克隆菌落，擴大培養(yǎng)后的菌液用通用引物MF47和MR48進行PCR檢測，初步檢測正確的菌液送生物公司進行測序。

1.2.3? DlZAT10基因的生物信息學(xué)分析? 使用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序結(jié)合數(shù)據(jù)庫對DlZAT10進行序列比對，使用在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子量、等電點、親疏水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等;使用Mega 4.1軟件內(nèi)置的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，設(shè)置Bootstrap值為1000;使用DNAMAN軟件進行多序列比對。

1.2.4? DlZAT10基因超表達載體構(gòu)建? 對克隆測序結(jié)果正確的基因，利用In-Fusion在線網(wǎng)站設(shè)計其超表達引物，分別命名為Oe-DlZAT10-F，Oe-DlZAT10-R（表1中Oe-DlZAT10），通過PCR擴增得到超表達的DlZAT10基因目的片段，利用膠回收試劑盒回收DlZAT10基因目的片段，用5X In-Fusion HD Enzyme Premix把目的片段連接入雙酶切質(zhì)粒PBI121-GFP中（具體方法參見說明書），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)擴繁后吸取150 μL涂于添加卡那霉素（100 mg/L）的LB平板上37 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d，隨后挑選陽性克隆菌落進行擴大培養(yǎng)，對其菌液進行PCR檢測。構(gòu)建的表達載體命名為PBI121-DlZAT10。

2? 結(jié)果與分析

2.1? DlZAT10基因ORF的克隆

以龍眼cDNA為模板，用設(shè)計好的巢式克隆引物進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到750 bp左右的擴增片段，回收目的片段并與PMD18-T載體連接，菌液PCR檢測后得到750 bp左右的目的基因片段（圖1），通過對陽性克隆菌落進行擴繁和測序，結(jié)果顯示DlZAT10基因ORF克隆序列與轉(zhuǎn)錄組ORF序列完全一致，該基因ORF全長738 bp，共編碼245個氨基酸。

2.2? DlZAT10基因生物信息學(xué)分析

2.2.1? DlZAT10編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測與分析? 利用在線軟件ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）預(yù)測和分析DlZAT10基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)[9]，結(jié)果顯示：該蛋白質(zhì)分子式為C1144H1778N338O362S11，原子總數(shù)為3633，分子量為26411.41 Da;由245個氨基酸組成，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為26，帶負(fù)電荷的（Asp+Glu）氨基酸殘基總數(shù)為22，理論等電點pI值為8.62，脂肪指數(shù)46.65，總親水性平均值（GRAVY）為?0.731，屬于親水性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)（II）為76.90，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2? DlZAT10蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析? 通過在線軟件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對DlZAT10蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，表明該蛋白屬于C2H2超家族，在多肽鏈的中央附近存在2個結(jié)合位點（圖2）。通過NCBI-BLAST工具與其他物種氨基酸序列進行比對分析，與預(yù)測結(jié)果相同，為C2H2型鋅指蛋白。

2.2.3? DlZAT10蛋白質(zhì)信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細胞定位的預(yù)測? 利用在線分析工具SignalSignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.1/）對DlZAT10蛋白進行信號肽分析，未發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白屬于非分泌型蛋白，不經(jīng)過修飾及轉(zhuǎn)運，直接在細胞內(nèi)起作用。利用在線軟件TM- HMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測DlZAT10蛋白的跨膜螺旋區(qū)，參照結(jié)果未發(fā)現(xiàn)跨膜螺旋區(qū)，表明該蛋白為非跨膜蛋白，推測蛋白合成后不經(jīng)其他途徑轉(zhuǎn)運，在細胞內(nèi)行使催化功能。用植物亞細胞定位在線分析工具PSORT II Prediction（https：//psort.hgc. jp/form2.html）進行亞細胞定位分析，結(jié)果顯示該蛋白定位于細胞核的概率為82.6%，定位于線粒體的概率為8.7%，定位于細胞骨架的概率為4.3%，定位于細胞質(zhì)的概率為4.3%，由結(jié)果推斷，DlZAT10蛋白定位于細胞核。

2.2.4? DlZAT10蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測? 利用在線預(yù)測工具NetPhos3.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）分析DlZAT10蛋白的磷酸化位點，結(jié)果顯示：該蛋白由40個氨基酸磷酸化位點（閾值>0.5）構(gòu)成，包含16個蘇氨酸（Threonine）、22個絲氨酸（Serine）和2個酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點（圖3）。推測DlZAT10蛋白活性的調(diào)控可能與磷酸化作用有關(guān)，且在DlZAT10蛋白中發(fā)生磷酸化修飾時以絲氨酸位點磷酸化為主。

2.2.5? DlZAT10蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析? 利用在線分析工具PredictProtein（https：// www.predictprotein.org/）對DlZAT10蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成，共占87.35%，此外α-螺旋占6.94%，β-折疊占5.71%。暴露在蛋白表面的殘基占73.06%，其他殘基占26.94%。利用SWISS-MODEL Workspace（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具預(yù)測DlZAT10蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成。

2.2.6? DlZAT10蛋白質(zhì)進化樹構(gòu)建和多重序列比對? 將DlZAT10氨基酸序列與NCBI中一致性較高的12種植物序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlZAT10蛋白與CrZAT10（柑橘Citrus reticulata）蛋白和PvZAT10-like（阿月渾子Pistacia vera）蛋白的親緣關(guān)系較近，且和CrZAT10（柑橘Citrus reticulata）、PvZAT10（阿月渾子Pistacia vera）、ZjZAT10（棗Ziziphus jujuba）、CsZAT10（山茶Camellia sinensis）、DzZAT10（榴蓮Durio zibethinus）、HbZAT10（巴西橡膠Hevea brasiliensis）、MeZAT10（木薯Manihot esculenta）聚為一類，推測可能在功能上也存在相似性，與AtZAT9-like（擬南芥Arabidopsis thaliana）、JrZAT10-like（核桃Juglans regia）、JcZAT10（麻楓樹Jatropha curcas）、RcZAT10（蓖麻Ricinus communis）親緣關(guān)系較遠（圖4）。

利用DnaMan V6軟件進行同源基因的多重序列比對，結(jié)果顯示該基因含有一個植物鋅指蛋白所特有且高度保守的氨基酸序列QALGGH，位于第109～114個氨基酸位置（圖5A），屬于C2H2家族轉(zhuǎn)錄因子，且包含一個大部分鋅指蛋白均具有的EAR基序（L/FDLNL/F（X）P），該基序位于蛋白質(zhì)的C端末（圖5B），具有活躍的抑制活性。

2.3? DlZAT10基因的超表達載體構(gòu)建分析

通過克隆測序鑒定，在目的基因兩端引入酶切位點XbaI和SmaI，導(dǎo)入PMD18-T載體，搖菌擴繁提取質(zhì)粒，然后用XbaI和SmaI雙酶切質(zhì)粒pMD18-T DlZAT10和表達載體質(zhì)粒PBI121，分別回收目的基因和PBI121大片段，獲得具有XbaI和SmaI酶切位點的目的基因和pBI121-GFP載體，采用5X In-Fusion HD Enzyme Premix把目的基因片段連入到PBI121-GFP載體中。連接產(chǎn)物采用菌液PCR鑒定，所用2對引物分別為Npt II-F和Npt II-R以及35S和Oe-DlZAT10-R（NptII為pBI121質(zhì)粒抗性基因，35S為PBI121質(zhì)粒啟動子）（表1）。35S和Oe-DlZAT10-R的菌液PCR擴增檢測獲得750 bp左右的目的片段（圖6A），Npt II-F和Npt II-R引物的菌液PCR擴增檢測獲得了750 bp左右的抗性基因片段（圖6B），證明目的基因已經(jīng)插入雙元表達載體PBI121-GFP中，超表達載體構(gòu)建成功。

3? 討論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析得到龍眼DlZAT10基因全長序列，通過篩選并結(jié)合克隆技術(shù)，成功地獲得了龍眼DlZAT10基因的ORF全長和超表達載體，并對其序列進行相關(guān)生物信息學(xué)預(yù)測和分析。ZAT10蛋白屬于C2H2鋅指蛋白家族的C1-2i亞家族，也是該亞家族中研究較為廣泛的一類蛋白，相關(guān)研究表明，ZAT10在模式植物擬南芥不同發(fā)育階段的防御及脅迫響應(yīng)中起著重要的作用[10]。

ZAT10最初被鑒定為鹽和冷響應(yīng)蛋白[11]，同時在滲透脅迫耐受性中也起著調(diào)控作用[12]。Lee等[13]通過熒光篩選法進一步證明了ZAT10在擬南芥植物的冷響應(yīng)機制中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。通過對比龍眼ZAT10和擬南芥ZAT10蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，擬南芥ZAT10蛋白三級結(jié)構(gòu)相對于龍眼ZAT10三級結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，含有更多的無規(guī)則卷曲和α-螺旋。通過NCBI數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)：DlZAT10蛋白序列與PvZAT10和CrZAT10的相似度較高，分別為78.23%和72.94%，推測在功能上可能也存在相似性。

ZAT10基因的過表達可提高轉(zhuǎn)基因植物擬南芥對鹽、高溫、干旱脅迫、滲透和外源H2O2脅迫的耐受性[14-15]，研究表明龍眼花芽形成時期適當(dāng)?shù)牡蜏亍⒏珊狄约把趸让{迫可以誘導(dǎo)龍眼成花[16]。在逆境條件下，鋅指蛋白可以作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄阻遏物，參與植物對不同環(huán)境下脅迫的防御和適應(yīng)反應(yīng)[17]。ZAT10是ZAT家族中受到廣泛研究的成員之一，已被證明可由干旱、鹽堿、滲透、氧化脅迫和ABA處理等誘導(dǎo)[18-19]。進一步推測龍眼ZAT10基因可能與龍眼抗逆及成花存在關(guān)聯(lián)。C2H2是一類重要的植物鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，本研究已經(jīng)完成了對DlZAT10基因的克隆、序列和蛋白的分析以及超表達載體pBI121-DlZAT10的構(gòu)建，該表達載體構(gòu)建為DlZAT10基因在擬南芥或龍眼植物的遺傳轉(zhuǎn)化進而構(gòu)建轉(zhuǎn)基因株系提供載體基礎(chǔ)，為該基因在龍眼和其他植物中的表達及該基因功能的進一步研究提供參考依據(jù)。

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責(zé)任編輯：白? 凈