COX-2和α-Synuclein在子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及相關(guān)性分析*

劉秋紅，聶嵐，盧艷，劉芳，李楊，林春麗

（湖南省婦幼保健院，湖南 長(zhǎng)沙410008）

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis, EMT）是育齡期婦女高發(fā)的慢性疼痛性疾病[1-3]?；颊叨喟椴辉邪Y，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量和幸福指數(shù)[4-7]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2, COX-2）和α-突觸核蛋白（以下稱為α-Synuclein）在多種激素調(diào)節(jié)下可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、介導(dǎo)炎癥損傷、腫瘤及EMT 發(fā)生[8-9]。雌激素代謝酶CYP1A1 和CYP1B1C均可上調(diào)兩者表達(dá)。本研究擬探討COX-2 和α-Synuclein 在EMT 合并不孕癥患者內(nèi)膜組織中的表達(dá)及相關(guān)性，為該疾病的診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月—2017年8月于湖南省婦幼保健院就診并接受治療的54 例EMT 合并不孕患者作為觀察組，其中增殖期和分泌期患者分別為28 和26 例。觀察組患者年齡26～52 歲，平均（43.12±4.45）歲。選取同期于湖南省婦幼保健院因子宮頸病變但不合并EMT 而接受子宮切除術(shù)的54 例患者作為對(duì)照組，其中增生期和分泌期患者各27 例。對(duì)照組患者年齡25～53歲，平均（42.45±4.34）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者的異位內(nèi)膜組織通過(guò)術(shù)后病理確診；EMT 合并不孕癥患者通過(guò)刮宮或手術(shù)切除獲得在位內(nèi)膜組織；患者均具備完整的病歷資料，并于術(shù)前簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前6 個(gè)月使用過(guò)激素治療者；有其他重要臟器功能障礙、心血管功能障礙、內(nèi)分泌疾病史者以及腫瘤病史者。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分離并收集兩組患者的內(nèi)膜組織，樣本依據(jù)患者臨床病理診斷確診為EMT 患者和非EMT 患者，將其相應(yīng)的內(nèi)膜組織分為EMT 在位內(nèi)膜組和EMT 異位內(nèi)膜組，分別有54 例。將所獲標(biāo)本置于液氮中完好保存，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 儀器與試劑

TRIzol 裂解液購(gòu)自美國(guó)AMRESCO 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq 酶購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，Western blotting 試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，人源COX-2 和α-Synuclein 一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signal 公司，二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法收集臨床組織標(biāo)本并制備石蠟切片，60℃烘烤2 h，常規(guī)脫蠟水化。隨后將組織切片并置于不銹鋼切片架上，放入含有Tris-EDTA 抗原修復(fù)液的耐熱燒杯中并置于微波爐中加熱至沸騰，重復(fù)2 次，取出燒杯，待Tris-EDTA 抗原修復(fù)冷卻至室溫后取出切片。采用3%過(guò)氧化氫孵育10 min，PBS 洗5 min/次，共3 次；DAKO 封閉液封閉，37℃孵育1 h；用DAKO 抗體稀釋液稀釋COX-2 和α-Synuclein 一抗并滴加于切片上，37℃孵育1 h；PBS 洗5 min/次，共3 次；滴加試劑Ⅰ，37℃孵育20 min，PBS 洗5 min/次，共3 次；滴加試劑Ⅱ，37℃孵育20 min；PBS 洗5 min/次，共3 次。在1 ml試劑Ⅱ中加入1 滴DAB 濃縮液，混合均勻并滴至切片上，顯色后立即停止。蒸餾水沖洗片子，蘇木精復(fù)染2 min；再次用蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化3～5 s，蒸餾水沖洗。梯度酒精70%、80%、95%及100%脫水，每個(gè)梯度3 min；二甲苯脫水15 min/次，共3 次。最后采用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察COX-2 和α-Synuclein 的表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果中胞膜和（或）胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞著色程度差異，陰性細(xì)胞以“-”表示，淡棕黃色細(xì)胞以“+”表示，淡棕黃色和深棕黃色之間的細(xì)胞以“++”表示，深棕黃色細(xì)胞以“+++”表示；在10 倍鏡下對(duì)6 個(gè)測(cè)試窗陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作為切片計(jì)數(shù)。

1.3.2 RT-PCR①總RNA 的提?。翰捎? ml Trizol裂解液對(duì)樣本進(jìn)行吹打裂解，將樣本移至1.5 ml EP管中，劇烈震蕩使之充分裂解，室溫靜置5 min后，每管加入200 μl氯仿后劇烈震蕩15 s以達(dá)到萃取目的，室溫靜置10 min 后，4℃、12 000 r/min 離心15 min，回收上層水相至新的1.5 ml EP 管，加入等體積異丙醇，輕微上下顛倒混勻后，4℃環(huán)境下以12 000 r/min離心15 min，棄上清，75%無(wú)水乙醇洗滌RNA 沉淀，4℃、12 000 r/min 離心5 min，棄上清，室溫下靜置10 min 待乙醇揮發(fā)完全，20～60 μl ddH2O 溶解RNA沉淀，Epoch紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA樣本進(jìn)行濃度測(cè)定；②采用日本TaKaRa 公司5×PrimeScript RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，10 μl體積的逆轉(zhuǎn)錄體系為：2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix+400 ng Total RNA，加無(wú)RNase水補(bǔ)齊至10 μl，用槍反復(fù)吹打混勻。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄完成后將cDNA樣本凍存至-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫虎跴CR 反應(yīng)：定量PCR 依據(jù)TaKaRa 公司2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。cDNA 原液在使用前先用無(wú)RNase 水稀釋20 倍。COX-2 和α-Synuclein引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA為模板，在25 μl 反應(yīng)體系內(nèi)分別擴(kuò)增COX-2、α-Synuclein 和GAPDH。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)在ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，60℃退火并延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，采用儀器自帶軟件進(jìn)行分析，基因相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算。分別采用α-Synuclein/GAPDH、COX-2/GAPDH 擴(kuò)增量表示組織標(biāo)本的相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.3 Western blotting取上述組織加入RIPA進(jìn)行勻漿后，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，收集上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量。取30 μg蛋白上樣進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳。電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1 h。然后分別加入COX-2、α-Synuclein 和β-actin 人源單克隆抗體（1∶500 稀釋），4℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人源IgG 二抗室溫孵育2 h。洗滌3 次，每次5 min，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行計(jì)值及統(tǒng)計(jì)分析。β-actin 抗體孵育方法與上述方法相同。每份樣本設(shè)5 個(gè)重復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組COX-2和α-Synuclein陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

各組COX-2 和α-Synuclein 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組較對(duì)照組高。見(jiàn)表2 和圖1。

表2 各組COX-2和α-Synuclein陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2 各組COX-2和α-Synuclein陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組別增殖期n COX-2 α-Synuclein對(duì)照組觀察組t 值P 值分泌期對(duì)照組觀察組t 值P 值27 26 19.46±1.76 86.35±6.73 4.263 0.013 3.21±1.34 73.29±6.26 3.947 0.015 27 28 12.83±1.32 54.74±3.17 3.521 0.017 1.78±1.13 51.52±3.03 3.426 0.022

2.2 各組COX-2和α-Synuclein mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

各組COX-2 和α-Synuclein mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EMT 在位內(nèi)膜組、EMT 異位內(nèi)膜組較對(duì)照組高。見(jiàn)表3。

2.3 各組分泌期和增殖期COX-2 和α-Synuclein mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

各組分泌期和增殖期COX-2 和α-Synuclein mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EMT 在位內(nèi)膜組、EMT 異位內(nèi)膜組較對(duì)照組高。對(duì)照組不同時(shí)期COX-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.724，P=0.018），α-Synuclein mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.988，P=0.021）；EMT 在位內(nèi)膜組不同時(shí)期COX-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.762，P=0.013），α-Synuclein mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.182，P=0.007）；EMT 異位內(nèi)膜組不同時(shí)期COX-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.899，P=0.034），α-Synuclein mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.682，P=0.024），且分泌期均較增殖期高。見(jiàn)表4。

圖1 各組織標(biāo)本中COX-2和α-Synuclein的陽(yáng)性表達(dá)與分布 （免疫組織化學(xué)法×10）

表3 各組COX-2和α-Synuclein mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 （n=54，±s）

表3 各組COX-2和α-Synuclein mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 （n=54，±s）

?組別COX-2 α-Synuclein對(duì)照組EMT在位內(nèi)膜組EMT異位內(nèi)膜組F值P值0.09±0.15 2.14±0.24 3.37±0.23 3.846 0.017 0.04±0.15 3.26±0.21 3.38±0.29 4.165 0.011

2.4 各組COX-2和α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組COX-2 和α-Synuclein 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EMT 在位內(nèi)膜組、EMT 異位內(nèi)膜組較對(duì)照組高。見(jiàn)表5 和圖2。

2.5 各組分泌期和增殖期COX-2、α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組分泌期和增殖期COX-2、α-Synuclein 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組較對(duì)照組高。對(duì)照組不同時(shí)期COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.782，P=0.017），α-Synuclein 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.811，P=0.001）；觀察組不同時(shí)期COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.281，P=0.001），α-Synuclein 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.122，P=0.001），且分泌期均較增殖期高。見(jiàn)表6 和圖3。

表4 各組分泌期和增殖期COX-2和α-Synuclein mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 （n=54，±s）

表4 各組分泌期和增殖期COX-2和α-Synuclein mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 （n=54，±s）

分泌期增殖期組別對(duì)照組COX-2 0.09±0.13 α-Synuclein 0.09±0.13 COX-2 0.04±0.12 α-Synuclein 0.04±0.15 EMT在位內(nèi)膜組EMT異位內(nèi)膜組F 值P 值3.28±0.14 3.37±0.17 4.184 0.014 3.27±0.12 3.38±0.19 4.269 0.012 2.61±0.13 2.45±0.18 3.824 0.015 2.29±0.14 2.35±0.11 3.927 0.018

表5 各組COX-2、α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=54，±s）

表5 各組COX-2、α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=54，±s）

組別COX-2照組MT在位內(nèi)膜組MT異位內(nèi)膜組1.13±0.32 2.13±0.39 3.28±0.65 α-Synuclein對(duì)E E F值P值3.243 0.009 1.86±0.45 2.89±0.79 4.22±0.61 3.927 0.006

圖2 各組COX-2、α-Synuclein蛋白的表達(dá)

圖3 各組分泌期和增殖期COX-2、α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.6 EMT 患者異位內(nèi)膜組織中COX-2 和α-Synuclein的相關(guān)性

經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析，EMT 患者異位內(nèi)膜組織中COX-2 與α-Synuclein 的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.885，P=0.001）。見(jiàn)圖4。

表6 各組分泌期和增殖期COX-2、α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=54，±s）

表6 各組分泌期和增殖期COX-2、α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=54，±s）

組別對(duì)照組增殖期COX-2 1.01±0.15 α-Synuclein 1.04±0.18分泌期COX-2 1.23±0.24 α-Synuclein 1.13±0.12觀察組t 值P 值1.63±0.24 1.947 0.021 1.95±0.23 2.047 0.013 1.76±0.27 1.864 0.024 2.34±0.31 2.674 0.009

圖4 COX-2和α-Synuclein的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

EMT 是臨床較為常見(jiàn)的婦科良性疾病，患者常伴隨有漸進(jìn)性痛經(jīng)及不孕等癥狀[10]。長(zhǎng)期的EMT 的發(fā)生、發(fā)展可導(dǎo)致兩側(cè)卵巢及輸卵管的破壞和退化，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢功能喪失[11]。近年來(lái)針對(duì)EMT 病因?qū)W的研究表明，子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)成分異位于子宮內(nèi)膜以外的區(qū)域是導(dǎo)致疾病發(fā)生、發(fā)展的主要因素，而細(xì)胞增生、局部炎癥損傷及新生血管的形成對(duì)促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體的侵襲具有重要的調(diào)節(jié)意義[6，12]。然而，臨床上關(guān)于EMT 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，對(duì)其預(yù)防和治療仍是臨床難點(diǎn)。在婦產(chǎn)科臨床工作中，EMT 的診治已由單純的手術(shù)治療向內(nèi)分泌聯(lián)合手術(shù)根治性治療的階段轉(zhuǎn)化，然而效果依然不甚理想[13]。因此，深入探究EMT 發(fā)生發(fā)展機(jī)制有望為該病防治藥物的研發(fā)提供新機(jī)制、新靶點(diǎn)和新方向。

COX 是前列腺素合成的重要限速酶，其表達(dá)異常與機(jī)體病理狀態(tài)密切相關(guān)。COX-2 是該家族中參與炎癥應(yīng)答的重要誘導(dǎo)酶，在心肌炎、帕金森病等多種慢性疾病發(fā)生、發(fā)展中大量釋放，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)患者的病理性損傷[14]。有研究證實(shí)，長(zhǎng)期慢性炎癥能夠誘導(dǎo)EMT 發(fā)生，炎癥環(huán)境中TNF-α、hs-CRP 和IL-1β 等多種炎癥因子的大量釋放，能夠誘導(dǎo)COX-2 的表達(dá)進(jìn)而加劇EMT 的病理進(jìn)程，此外特異性抑制COX-2 能夠有效抑制腹腔鏡術(shù)后的EMT 的復(fù)發(fā)率，提示COX-2 參與調(diào)控EMT 的發(fā)生、發(fā)展[9]。α-Synuclein是重要的介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的突觸前膜蛋白，前期研究報(bào)道α-synuclein 突變、聚集和過(guò)度積累與阿爾茲海默癥和帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病，以及子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。α-synuclein表達(dá)上調(diào)可通過(guò)激活mTOR信號(hào)而抑制細(xì)胞自噬，進(jìn)而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性間質(zhì)包括COX-2等的釋放，加劇病理進(jìn)程。

有研究表明，多種神經(jīng)退行性疾病的炎癥環(huán)境中COX-2 和α-synuclein 表達(dá)上調(diào)能夠協(xié)同并互相誘導(dǎo)促進(jìn)機(jī)體炎癥損傷，加劇疾病的發(fā)生、發(fā)展[16]。然而，兩者在EMT 中的表達(dá)、相互作用和分子機(jī)制目前尚未報(bào)道，闡明COX-2 和α-synuclein 在EMT 中的功能和機(jī)制有望為臨床疾病的預(yù)防和診療提供新策略和理論依據(jù)?；诖耍狙芯恐饕接慍OX-2和α-synuclein 在EMT 患者異位內(nèi)膜中的表達(dá)和相關(guān)性以及對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 和α-Synuclein 在EMT 患者的異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)較正常內(nèi)膜組織明顯升高；且兩者在正常子宮內(nèi)膜和異位內(nèi)膜分泌期表達(dá)均顯著高于增殖期。此外，本研究證實(shí)異位內(nèi)膜組織中COX-2 與α-Synuclein 的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者相互協(xié)同致使內(nèi)膜細(xì)胞異位、促進(jìn)細(xì)胞紊亂和增生失控，加劇血管新生，繼而發(fā)生異位病灶，加劇EMT 的病理進(jìn)程。

綜上所述，COX-2 和α-Synuclein 蛋白可能通過(guò)參與EMT 發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵的血管生成機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)EMT 及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。因此，對(duì)COX-2和α-Synuclein 的深入研究可為EMT 的治療提供新的靶點(diǎn)。