益氣化痰活血方對動脈粥樣硬化小鼠主動脈p-NF-κB(p65)、p-IκB表達的影響

郭楊志 杜娟 姜敏 郭偉

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種以血清中異常升高的脂類物質為啟動因子，伴有多種炎癥因子參與的炎癥性動脈疾病，以動脈內(nèi)膜下脂質沉積、內(nèi)膜纖維性增厚、AS斑塊形成為主要病理變化[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除小鼠構建的AS模型中，核因子κB(nuclear factor-kappa B， NF-κB)通路相關炎性因子，如可溶性細胞間黏附分子-1、可溶性血管細胞黏附分子-1均明顯升高，主動脈弓內(nèi)的NF-κB表達較正常小鼠增多，而以益氣化痰活血法為治療原則的調(diào)脂通脈顆粒對以上蛋白表達具有一定抑制作用[2-3]。在本研究中，課題組以NF-κB通路中的NF-κB(p65)及κB 抑制蛋白(inhibitor of κB，IκB)的磷酸化產(chǎn)物為切入點，進一步探討調(diào)脂通脈顆粒改善AS病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6周齡ApoE基因敲除雄性小鼠30只，同種系6周齡C57 BL/6 J雄性小鼠10只，體重均為(22±2)g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京) 2012-0001。實驗小鼠飼養(yǎng)于北京市衛(wèi)生局臨床藥學研究所SPF級動物房，飼養(yǎng)條件：室溫22～24℃，相對濕度50%, 光照時間7:00～19:00，各組小鼠均自由采食攝水。研究期間所有操作嚴格依照首都醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的要求進行。

1.2 實驗藥物

調(diào)脂通脈顆粒由太子參25 g、丹參25 g、紅花10 g、陳皮15 g、茯苓25 g、澤瀉25 g等組成，湯藥組方飲片量由北京康仁堂藥業(yè)有限公司配制，為全成分顆粒劑；非諾貝特膠囊(力平之，注冊證號：H20100602)，購自法國利博福尼制藥公司。

1.3 主要試劑與儀器

一抗兔抗鼠p-NF-κB(p65)、p-IκB多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號：3033、2859)；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗(美國Jackson公司，批號：111-035-003)；熒光(Cy3)標記的山羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1032)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京Cwbiotech公司，批號：02912E); DAB顯色劑及EDTA抗原修復液，均購自北京中科萬邦生物科技有限公司; 普通飼料及高脂飼料(脂肪21%、膽固醇0.15%、普通飼料78.85%)均購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，合格證號：SCXK(京) 2014-0010。

高速冷卻離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；電泳儀(美國 Bio-Rad公司)；形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)；全自動生化儀AU480(日本 Olympus公司)；光學顯微鏡(日本 Olympus公司)；轉膜系統(tǒng)及凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；PH檢測儀(德國 Sartorius公司)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；酶標儀(美國 Thermo公司)；病理切片機(德國徠卡公司)；熒光顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)。

1.4 造模分組及給藥

30只ApoE基因敲除小鼠使用隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、非諾貝特組和調(diào)脂通脈顆粒組，每組各10只，在高脂飲食飼養(yǎng)基礎上，分別予生理鹽水、非諾貝特及調(diào)脂通脈顆粒灌胃。另取10只C57BL/6J小鼠予普通飲食飼養(yǎng)，并予等量生理鹽水灌胃。各組藥物用量參考《藥理實驗方法學》[4]及課題組前期研究制定[2,5]。非諾貝特用量：30 mg/kg(為人用量的9.01倍)；調(diào)脂通脈顆粒用量：以調(diào)脂通脈顆粒飲片方人用生藥量的20倍作為小鼠實驗用量，再將對應用量的飲片提取為顆粒劑，最終用量相當于生藥量為110 g/(kg·d)。各組適應性飼養(yǎng)1周后，每日給藥1次，連續(xù)給藥12周。

1.5 實驗動物取材

各組連續(xù)給藥12周，最后一次用藥干預后，各組小鼠禁食、不禁水12小時，麻醉并稱重后采用眼球取血法收集約1 mL血量，靜置2小時，3000 r/min，離心15分鐘，分離血清并分裝，-80℃冰箱保存。取血后，暴露并分離各組小鼠主動脈弓及腹主動脈組織。將主動脈弓組織橫向分為兩份，均投入4%多聚甲醛溶液固定，分別進行病理觀察及熒光免疫染色。腹主動脈組織放入液氮中短時保存，再置于-80℃冰箱中保存待測。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 血清生化指標測定 使用全自動生化分析儀，采用氧化酶法測定小鼠血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(thyroglobulin，TG)水平，采用直接法測定低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。

1.6.2 病理學觀察 將4%多聚甲醛固定后的小鼠主動脈弓組織常規(guī)石蠟包埋切片，每張切片厚度約5 μm。常規(guī)HE染色后，使用光學顯微鏡觀察主動脈弓組織內(nèi)膜結構及AS斑塊表現(xiàn)，并于高倍鏡(×400)視野下拍照。

1.6.3 熒光免疫染色 將小鼠主動脈弓組織常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm，分別經(jīng)二甲苯及乙醇處理后，加入EDTA修復液，于微波爐內(nèi)修復。經(jīng)PBS沖洗3次后，滴加1∶100的一抗兔抗鼠p-NF-κB(p65)多克隆抗體，4℃過夜；再次 PBS沖洗，加入熒光(Cy3)標記的山羊抗兔 IgG二抗，于37℃溫箱內(nèi)孵育30分鐘，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)液復染，使用水溶性封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察p-NF-κB(p65)表達，高倍鏡(×200)視野下拍照。

1.6.4 NF-κB經(jīng)典通路蛋白表達 使用Western blot法檢測各組小鼠腹主動脈內(nèi)的p-NF-κB(p65)、p-IκB蛋白水平。預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑。組織按10%勻漿，即20 mg組織加入200 μL RIPA裂解液，電動勻漿器30000 r/min，勻漿10分鐘，于4℃，13000 r/min離心20分鐘，取上清進行蛋白定量及蛋白樣本制備。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度，并以RIPA調(diào)整蛋白濃度，樣品終濃度為3 μg/uL。每泳道上樣蛋白30 μg，SDS-PAGE電泳后，電轉膜至PVDF膜， 加入1∶1000兔抗鼠 p-NF-κB(p65)、p-IκB多克隆抗體、GAPDH，4℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入 HRP標記的羊抗兔二抗，1小時后，TBST洗滌3次，每次10分鐘。將ECL滴加到膜的蛋白面，反應3分鐘，膠片曝光后顯影2分鐘，定影。 圖片掃描后，使用Gel Image system(上海天能科技有限公司，4.00版本)進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 血清血脂水平

與正常組比較，模型組、調(diào)脂通脈顆粒組、非諾貝特組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，調(diào)脂通脈顆粒組、非諾貝特組小鼠血清TG明顯降低(P<0.05)；與非諾貝特組比較，調(diào)脂通脈顆粒組小鼠血清TG水平明顯降低(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果見表1。

表1 各組AS小鼠血清血脂水平比較只)

2.2 主動脈弓HE染色

正常組主動脈內(nèi)膜光滑，結構完整，局部無斷裂及缺損，內(nèi)膜無增厚、無炎性細胞浸潤， 管壁無可見斑塊，血管管腔通暢無狹窄(圖1A)。模型組內(nèi)膜結構局部斷裂而不連續(xù)，部分內(nèi)膜明顯增厚，并可見炎性細胞浸潤，在內(nèi)膜局部還可看到大量脂類物質進入內(nèi)膜下形成的膽固醇結晶及較大斑塊，血管管腔壁明顯狹窄，斑塊纖維帽較薄(圖1B)。調(diào)脂通脈顆粒組及非諾貝特組主動脈內(nèi)膜亦可觀察到增厚及局部結構破壞(圖1C、D)，并可在內(nèi)膜局部觀察到脂類物質沉積形成的粥樣斑塊。與模型組比較，調(diào)脂通脈顆粒及非諾貝特組斑塊內(nèi)部的膽固醇結晶較少，且調(diào)脂通脈顆粒組斑塊纖維帽較厚。

注：A正常組；B模型組；C調(diào)脂通脈顆粒組；D非諾貝特組。

2.3 主動脈弓p-NF-κB(p65)熒光免疫染色

正常組可見主動脈內(nèi)膜結構連續(xù)完整，其內(nèi)可見紅色熒光顯示的p-NF-κB(p65)表達(圖2A)。與正常組比較，模型組主動脈弓內(nèi)皮增厚，局部斷裂，結構不完整，并可見p-NF-κB(p65)表達增多，紅色熒光密集分布于主動脈內(nèi)皮上(圖2B)。與模型組比較，非諾貝特組和調(diào)脂通脈顆粒組主動脈弓結構尚完整，損傷較模型組小，內(nèi)膜中的紅色熒光亮度低于模型組(圖2C、D)。

2.4 腹主動脈p-NF-κB(p65)、p-IκB蛋白表達

模型組小鼠腹主動脈p-NF-κB(p65)、p-IκB表達明顯高于正常組(P<0.05)；經(jīng)藥物干預后，非諾貝特組、調(diào)脂通脈顆粒組腹主動脈p-NF-κB(p65)、 p-IκB表達較模型組明顯降低(P<0.05)。而與非諾貝特組比較，調(diào)脂通脈顆粒組腹主動脈p-NF-κB(p65)、p-IκB表達差異不明顯，結果見表2、圖3。

注：A正常組；B模型組；C調(diào)脂通脈顆粒組；D非諾貝特組。

表2 各組AS小鼠腹主動脈p-NF-κB、 p-IκB蛋白表達比較

注：A正常組；B模型組；C調(diào)脂通脈顆粒組；D非諾貝特組。

3 討論

脂類代謝異常導致低密度脂蛋白、氧化型低密度脂蛋白等脂質向血管內(nèi)皮下浸潤，是AS的重要病因，而血清TG及富含TG脂蛋白水平升高，均具有類似LDL-C的致AS作用[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)脂通脈顆粒可有效降低血清TG水平，且其主動脈弓處形成的斑塊，較模型組損傷較小，提示調(diào)脂通脈顆粒可能通過降低血清TG水平，起到一定的改善AS斑塊形成的作用。

NF-κB是AS炎癥反應過程中的關鍵因子。在無轉錄活性的靜息狀態(tài)下，組成NF-κB蛋白二聚體的RelA(p65)及p50停留在胞漿中，并與IκB結合。當炎癥因子等刺激時，IκB 的上游激酶(IκB kinase， IKK)激活并使 IκB磷酸化(p-IκB)及泛素化而降解。由于p50亞基有核定位信號，IκB降解后p50同RelA(p65)移入細胞核內(nèi)。而磷酸化的RelA(p-RelA)能識別并結合特定的DNA序列，發(fā)揮其對靶基因轉錄的調(diào)控作用[9-10]。在本研究疫熒光染色中發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠主動脈內(nèi)皮即有一定量的 p-NF-κB(p65)表達，說明在生理情況下血管內(nèi)皮存在一定量激活的NF-κB，以維持內(nèi)皮生理功能。模型組可見p-NF-κB(p65)熒光亮度明顯增加，即蛋白表達增多，可能提示AS過程中活躍的炎癥反應。經(jīng)調(diào)脂通脈顆粒組干預后，p-NF-κB(p65)熒光亮度下降，蛋白表達受到抑制，推測調(diào)脂通脈顆?？赡芫哂幸种?NF-κB磷酸化，從而緩解AS病變的作用。此外，在本研究的Western blot檢測中觀察到，調(diào)脂通脈顆粒能夠明顯減少腹主動脈p-NF-κB(p65)及p-IκB蛋白表達，結合課題組前期發(fā)現(xiàn)其對動脈粥樣硬化過程中黏附分子表達的影響[5]，說明調(diào)脂通脈顆粒對NF-κB及其下游炎癥因子均有一定的抑制作用。

在AS的臨床治療中，調(diào)節(jié)血脂水平藥物和抑制血小板聚集藥物是目前重要的防治手段[11]。雖然對于NF-κB及其下游炎性因子參與動脈粥樣硬化發(fā)病的機制研究已有了大量成果，但臨床上仍缺乏將NF-κB直接作為干預靶點的藥物。這可能由于NF-κB除了參與多種疾病的病理過程之外，更具有維持機體正常免疫應答反應、維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)等重要生理功能。而以高濃度、強作用的化學藥物抑制NF-κB，雖然體外實驗效果明顯，但應用于人體可能直接導致細胞功能障礙從而損傷機體[12]。但目前研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥復方對NF-κB及其通路相關因子都有不同程度的調(diào)節(jié)作用[13-14]，而調(diào)脂通脈顆粒以益氣化痰活血為指導原則，亦對NF-κB因子及其下游炎癥產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)作用，似乎能夠成為防治AS的補充手段。

總之，本研究說明調(diào)脂通脈顆粒具有改善AS病變的作用，該作用可能與其抑制血管內(nèi)皮的NF-κB磷酸化、減少p-NF-κB(p65)、p-IκB蛋白表達相關。