基于斑馬魚在體模型高效篩選補骨脂配伍減毒研究

寧青，劉中秋，韋英杰,胡明

(1.廣州中醫(yī)藥大學國際中醫(yī)藥醫(yī)學轉化研究所，廣東 廣州 510006；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210028)

補骨脂是具有補腎壯陽、溫脾止瀉之效的傳統(tǒng)中藥，臨床應用廣泛，2015年版《中國藥典》收載含補骨脂的成方制劑達41種[1]。隨著補骨脂及其制劑的廣泛應用，臨床上陸續(xù)出現(xiàn)肝損傷病例報道[2-4],其潛在肝毒性風險逐漸顯現(xiàn)。國家藥品監(jiān)督管理局已先后通報了含補骨脂的制劑導致肝損傷的不良反應[5-7]。在2017版《醫(yī)保目錄》中也報道了含補骨脂的中成藥導致的42例肝損傷病例[8]。早在2009年Cheung等[9]報告指出3例急性肝炎患者均使用補骨脂注射劑或含有補骨脂的方劑，提出補骨脂素及其相關化學品可能導致肝毒性，并指出與其他草藥同煎可能會導致較高濃度的有毒成分和更嚴重的肝損傷。補骨脂化學成分復雜，主含香豆素類、黃酮類和補骨脂酚等成分，其中補骨脂素是補骨脂中主要活性成分，亦被認為是主要的毒性成分。

王永炎和張伯禮提出了以組分配伍研制現(xiàn)代中藥的有效組分配伍研究新策略[10]，中藥配伍減毒是方劑的特色優(yōu)勢，是中醫(yī)方劑理論的重要組成部分之一，對臨床合理用藥有重要指導意義。配伍減毒也是最常用的減毒方法之一，其現(xiàn)代研究是國家中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展戰(zhàn)略的重要研究內容[11]。如何科學合理地進行配伍減毒研究是目前大家都較為關注的問題。現(xiàn)有體內外毒性評價法均存在相應弊端：體內毒性實驗周期長、成本高、化合物用量大，難以進行大規(guī)模高效的毒性篩選；體外細胞實驗快速，但實驗結果常常與體內實驗有較大差別。在此基礎上，本文嘗試采用斑馬魚在體模型進行補骨脂配伍減毒篩選研究。斑馬魚是近年來進行藥物在體高通量篩選、毒性和代謝等研究的熱門模式生物[12-14]。斑馬魚毒性評價法已在國內外廣泛用于藥物的安全性評價[15-16]。本文以補骨脂素為目標毒性成分，研究臨床不同藥味配伍補骨脂素的變化來快速篩選目標減毒藥味及成分，并從轉錄組水平揭示桃葉珊瑚苷配伍補骨脂素減毒的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗用斑馬魚成魚(南京堯舜禹生物科技有限公司)為德國Tuebingen品系斑馬魚，胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行。在(28±0.5)℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎(養(yǎng)魚用水水質:每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為450～510 μS/cm，pH為6.9～7.2)。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 試劑 補骨脂素購自國家食品藥品檢定研究院(Psoralen，PS，純度98%，批號：110739-201617)；桃葉珊瑚苷購自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司(Au，純度>98%，批號:D1905130138030113)；培養(yǎng)基母液：5 mmol/L NaCl,0.17 mmol/L KCl,0.33 mmol/L CaCl2,0.33 mmol/L MgSO4；RNeasy microarray tissue mini kit購自Qiagen(批號：73304)；NEBNext Ultra Ⅱ RNA購自NEB(批號：E7770L)；Ampure XP購自貝克曼(批號：A63880)；QubitTM1× dsDNA HS Assay購自Thermo Fisher(批號：Q33233)； 瓊脂糖購自索來寶(批號：YZQZT)；TBE緩沖液購自索來寶(批號：T1051)；GelGreen染料購自Biotium(批號：41013)；DNA loading buffer ×6購自索來寶(批號：D1010)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

1.2.2 藥材 見表1。

1.3 儀器

尼康ECLIPSE-Ci正置顯微鏡(日本Nikon公司)；尼康DS-Fi3顯微鏡相機(日本Nikon公司)；SPX-80生化培養(yǎng)箱(寧波海曙賽褔實驗儀器廠)；Organomation N-EVAP TM 112氮吹儀(美國Origanomation Associates公司)；KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler Toledo ABMS105DU分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

表1 藥材來源

2 方法

2.1 供試液的配制

2.1.1 補骨脂素供試液的制備 精密稱取適量補骨脂素加入適量DMSO溶解，配制成補骨脂素母液，再用斑馬魚培養(yǎng)基分別稀釋成25、50、100 μmol/L的補骨脂素供試藥液，供斑馬魚毒性評價用。

2.1.2 不同藥味供試液的制備 通過文獻研究及課題組前期試驗結果[17-19]，篩選了女貞子、桑寄生、五味子、骨碎補、杜仲、菟絲子及淫羊藿7味中藥進行配伍研究。分別稱取補骨脂、女貞子、桑寄生、五味子、骨碎補、杜仲、菟絲子及淫羊藿飲片適量，加10倍量水提取2次，每次1 h，合并煎液，濾過，分裝藥液，每管藥液相當于100 mg原生藥量，氮氣吹干，臨用時加10 mL斑馬魚培養(yǎng)基溶解，作為母液，供斑馬魚毒性評價試驗用。

2.1.3 不同藥味與補骨脂素配伍樣品的制備 取不同藥味供試液母液0.25 mL，加入一定量補骨脂素，采用斑馬魚培養(yǎng)基配制成25、50、100 μmol/L(以補骨脂素計)的供試液，供斑馬魚毒性評價試驗用。

2.1.4 桃葉珊瑚苷與補骨脂素配伍樣品的制備 分別精密稱取補骨脂素和桃葉珊瑚苷適量加入適量DMSO溶解，配制成補骨脂素和桃葉珊瑚苷母液，再用斑馬魚培養(yǎng)基配制成高(補骨脂素200 μmol/L，桃葉珊瑚苷100 μmol/L)、中(補骨脂素150 μmol/L，桃葉珊瑚苷75 μmol/L)、低(補骨脂素100 μmol/L，桃葉珊瑚苷50 μmol/L)濃度配伍溶液，供斑馬魚毒性評價以及RNA-Sep使用。

2.2 實驗方法

2.2.1 斑馬魚毒性評價試驗 胚胎由斑馬魚成魚自然交配產生，將胚胎放置于斑馬魚培養(yǎng)基中，在(28.0±0.5)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取受精后1 d(1 dpf)斑馬魚胚胎，置24孔板中，每孔8個胚胎，每組16個胚胎，分別暴露于不同質量濃度的供試液中，每孔2.0 mL溶液，用培養(yǎng)基為對照組。以卵凝結、心臟停跳作為死亡終點，每天計數(shù)胚胎和/或幼魚死亡數(shù)量，顯微觀察幼魚的行態(tài)/形態(tài)，并于3 dpf時拍照，一直記錄到6 dpf。

2.2.2 RNA-Sep測序 胚胎由斑馬魚成魚自然交配產生，將胚胎放置斑馬魚培養(yǎng)基中(28.0±0.5)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取受精后1 d(1 dpf)斑馬魚胚胎，置6孔板中，每孔20個胚胎，每組40個胚胎，分別暴露于不同的供試液中，每孔5.0 mL溶液，分別設置對照組(培養(yǎng)基)、補骨脂素組(補骨脂素)、配伍組(補骨脂素與桃葉珊瑚苷配伍)，以卵凝結、心臟停跳作為死亡終點，每天將死亡的胚胎取出,直到6 dpf，將未死亡的樣品采用標準提取方法提取RNA，構建文庫。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Illumina測序。

2.3 數(shù)據(jù)分析

斑馬魚毒性評價試驗利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS20.0計算2～6 dpf的斑馬魚半數(shù)死亡濃度(LC50)。RNA-Sep測序數(shù)據(jù)使用HISAT2軟件進行mapping。參考基因組為Zebrafish(Danio rerio,GRCz11)，所用的軟件為HISAT2。

3 結果

3.1 不同藥味提取液對斑馬魚的影響

斑馬魚受精3 dpf后孵化成幼魚，各臟器發(fā)育基本完全，魚體透明，在載玻片上易側臥，顯微鏡下檢視臟器形態(tài)清楚、直觀。斑馬魚經過不同藥味提取液暴露后，對3 dpf斑馬魚胚胎及幼魚進行動態(tài)檢視，形態(tài)結果見圖1，致死率結果見圖2。

形態(tài)結果表明，與培養(yǎng)基組比，不同藥味提取液對斑馬魚影響不一，在相同濃度條件下，杜仲、桑寄生、骨碎補對斑馬魚影響最小，女貞子、菟絲子其次，淫羊藿、五味子影響最大。淫羊藿1 500、2 000、3 000 μg/L 3組幼魚(3 dpf)卵黃囊吸收延滯且腫大，心包腫大，眼睛變小，脊柱彎曲，呈顯著中毒表現(xiàn)。五味子組在1 000、2 000 μg/L濃度下，心包開始逐漸腫大；在2 000、3 000 μg/L濃度下，幼魚全部死亡。菟絲子500 μg/L及以上組卵黃囊吸收延滯且腫大，心包腫大。桑寄生組2 000 μg/L及以上組卵黃囊顏色稍發(fā)黑，形態(tài)變化不明顯。杜仲各濃度對幼魚形態(tài)無變化。從形態(tài)上分析，毒性影響大小依次為：五味子>淫羊藿≈菟絲子>女貞子>骨碎補>桑寄生>杜仲。

致死率結果表明，女貞子、杜仲各組中未見死亡；骨碎補3 000 μg/mL組中，死亡率小于20%，其他各濃度組未死亡。相關文獻表明死亡率小于20%的給藥濃度為安全濃度[20]。而菟絲子、淫羊藿和桑寄生給藥濃度1 500 μg/mL以上組中，死亡率大于20%，顯示有一定毒性。從致死率結果分析，毒性大小依次為五味子>淫羊藿>菟絲子>桑寄生>骨碎補>女貞子>杜仲。

圖1 不同藥味提取液對斑馬魚形態(tài)的影響

圖2 不同藥味作用斑馬魚的給藥時間-劑量-死亡率關系及 LC50值

3.2 不同藥味提取液與補骨脂素配伍對斑馬魚的影響

補骨脂素被認為是補骨脂中主要的毒性成分，因此我們以補骨脂素為研究對象，首先研究了補骨脂素單體對斑馬魚胚胎的毒性影響，繼而采用不同藥物提取液在安全濃度范圍內與之配伍，觀察配伍后藥液對斑馬魚的影響，結果見圖3～4。

圖3 不同藥味提取液與補骨脂素配伍對斑馬魚的影響

圖3結果表明：補骨脂素單用后，斑馬魚幼魚(3 dpf)卵黃囊明顯腫大，頭頸彎曲，眼睛變小，呈明顯中毒表現(xiàn)；補骨脂素與杜仲、女貞子、桑寄生提取液配伍后，可明顯改善魚臟器變形，從行態(tài)/形態(tài)上有顯著減毒效果；骨碎補次之；補骨脂素配伍五味子、菟絲子、淫羊藿提取液后，未見毒性減小。配伍減毒效果從大到小依次為：杜仲>桑寄生>女貞子>骨碎補>淫羊藿>菟絲子>五味子。

圖4結果表明，補骨脂素低濃度25 μmol/L組中未見死亡；50 μmol/L組中，死亡率小于20%，而高濃度100 μmol/L組中，給藥4 d后于5 dpf時死亡率超過50%。不同藥味提取液與其配伍后發(fā)現(xiàn)，杜仲+補骨脂素、女貞子+補骨脂素、桑寄生+補骨脂素3組在不同濃度給藥期間均未見魚死亡，提示這3種藥味可以有效地減輕補骨脂素的毒性。骨碎補+補骨脂素組出現(xiàn)中濃度死亡，但死亡率低于20%；菟絲子+補骨脂素、淫羊藿+補骨脂素、五味子+補骨脂素這3組在中、高濃度下，都會導致斑馬魚的死亡，并未有效地降低補骨脂素的毒性。

綜合不同藥味提取液以及不同藥味提取液配伍補骨脂素對斑馬魚行態(tài)/形態(tài)、給藥時間-劑量-死亡率結果，杜仲、女貞子、桑寄生提取液配伍后具有一定的減毒作用，其中杜仲的效果最優(yōu)；骨碎補配伍后對毒性影響較小，菟絲子、五味子、淫羊藿配伍后加大了對斑馬魚的毒性影響。

3.3 杜仲活性成分桃葉珊瑚苷與補骨脂素配伍對斑馬魚的影響

為探討杜仲配伍補骨脂素減毒作用可能的機制，在課題組前期研究基礎上，選擇杜仲中活性成分桃葉珊瑚苷與補骨脂素配伍，觀察桃葉珊瑚苷與補骨脂素配伍后對斑馬魚的影響，結果見圖5。給藥結束后，將未死亡的斑馬魚樣品采用標準提取方法提取RNA，進行RNA-Sep測序研究。

圖5結果表明，與培養(yǎng)基組相比，補骨脂素100、150、200 μg/mL組幼魚(3 dpf)卵黃囊、心包明顯腫大，身體變短，眼睛變小、顏色變淺；200 μg/mL組幼魚(3 dpf)身體彎曲顯著；均呈明顯中毒表現(xiàn)。加入桃葉珊瑚苷配伍后，100、150 μg/mL組幼魚(3 dpf)未見明顯改變；200 μg/mL組幼魚(3 dpf)心包、卵黃囊稍微腫脹，不明顯，中毒表現(xiàn)較補骨脂素組得到全面顯著改善。圖6結果表明，補骨脂素單用情況下，給藥72 h后，100、200 μg/mL組魚卵6.25%死亡；給藥96 h后，200 μg/mL組魚卵100%死亡；給藥12 h后，100 μg/mL組魚卵75%死亡，150 μg/mL組魚卵93.75%死亡。配伍桃葉珊瑚苷之后，100、150 μg/mL濃度組無死亡；給藥120 h后，200 μg/mL濃度組魚卵25%死亡。補骨脂素配伍桃葉珊瑚苷后的毒性較單用補骨脂素時顯著降低，提示配伍后有顯著減毒的效果。

圖5 桃葉珊瑚苷與補骨脂素配伍對斑馬魚的影響

圖6 桃葉珊瑚苷配伍補骨脂素作用斑馬魚的給藥 時間-劑量-死亡率關系

3.4 桃葉珊瑚苷與補骨脂素配伍RNA-Seq結果分析

3.4.1 不同組RNA-Seq數(shù)據(jù)差異分析 對照組、補骨脂素組和配伍組RNA-Seq的PCA如圖7A顯示，對照組與另2組差異較大，而補骨脂素組、配伍組2組間PC1(占57.19%)相似，僅存在PC2(占42.8%)的差異，3組在轉錄組表達特征上明顯不同。相關性系數(shù)，如圖7C所示，對照組與其他2組相關性低，而給藥2組相關性較高但有差別。圖7B、D～E展示了所有轉錄組的總體分布，以小提琴圖、密度圖、箱線圖展示3組間轉錄組分布趨勢相近，但存在部分轉錄本的差異?；鹕綀D(圖7G～I)和熱圖(圖7F)體現(xiàn)3組間基因轉錄水平上的差異，補骨脂素組和配伍組組間上調或下調基因數(shù)少，而與對照組相比差異表達的基因明顯增加。補骨脂素組相對對照組mRNA下調305個(FC<0.5)，上調355個(FC>2)，共21 712個。配伍組相對對照組mRNA下調415個，上調432個，共21 800個。配伍組相對補骨脂素組mRNA下調60個，上調59個，共21 675個。

3.4.2 KEGG和GO富集分析 KEGG富集見圖8，補骨脂素組相比對照組，上調組中藥物代謝、谷胱甘肽代謝、化學致癌性通路值得關注。GO富集分析中，上調組中靜脈曲張通路值得關注，下調組中免疫與炎癥相關的通路值得關注。本組出現(xiàn)明顯的因加藥導致的應激反應，如藥物代謝(Drug metabolism-other enzymes, Drug metabolism-cytochrome P450)相關通路的上調，可以加速體內藥物的代謝速度；谷胱甘肽代謝通路(Glutathione metabolism)上調，谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用，半胱氨酸上的巰基為其活性基團易與某些藥物、毒素等結合，使其具有整合解毒作用；化學致癌特征(Chemical carcinogenesis)，致癌物通過多種基因毒性和非基因毒性機制發(fā)揮作用。這些基因毒性和非基因毒性機制可以改變信號轉導途徑，最終導致過度突變、基因組不穩(wěn)定、增殖控制喪失和對細胞凋亡的抵抗。在免疫與炎癥方面也受到了異常抑制，并且加藥導致的分解的化學反應和途徑也出現(xiàn)了異常。

A.對照組、補骨脂素組和配伍組RNA-seq表達量主成分分析圖；B.對照組、補骨脂素組和配伍組表達量(FPKM)分布的小提琴圖；C.對照組、補骨脂素組和配伍組相關性熱圖；D.對照組、補骨脂素組和配伍組各基因FPKM密度分布圖；E.對照組、補骨脂素組和配伍組的表達量箱線圖；F.對照組、補骨脂素組和配伍組的歸一化后的聚類熱圖；G.補骨脂素組和對照組表達比較的火山圖紅點為上調基因(FC>2)，藍點為下調基因(FC<0.5)，灰點為無差異基因(0.5

配伍組相比對照組，KEGG(圖8)中上調組中藥物代謝通路值得關注,下調組中腫瘤壞死因子、慢性粒細胞白血病、甲狀腺癌通路值得關注。GO中下調組中免疫調節(jié)、急性炎癥反應相關的通路值得關注。本組出現(xiàn)明顯的因加藥導致的應激反應，如藥物代謝相關通路的上調，可以加速體內藥物的代謝速度；誘導細胞凋亡、細胞存活、炎癥和免疫的信號通路下調；慢性髓系白血病的信號通路下調；甲狀腺癌的信號通路下調。在細胞或有機體的保護過程、調節(jié)炎癥、體液免疫反應的頻率、速率或程度的過程出現(xiàn)異常；并且加藥導致的分解的化學反應和途徑亦出現(xiàn)了異常。

配伍組相比補骨脂素組，KEGG(圖8)中上調組中前列腺癌、神經營養(yǎng)因子通路、長壽調節(jié)通路、HIF-1通路值得關注，下調組中cAMP通路、化學致癌性通路值得關注。GO中無重要關注的富集。本組同樣出現(xiàn)了因加藥導致的應激反應，如藥物代謝相關通路的上調，可以加速體內藥物的代謝速度；血小板激活通路的上調，在破壞血管壁完整性的止血中起著關鍵和有益的作用；神經營養(yǎng)因子通路的上調，神經營養(yǎng)因子是參與神經細胞分化和存活的營養(yǎng)因子家族；長壽調節(jié)通路的上調，長壽的調節(jié)取決于遺傳和環(huán)境因素；轉錄因子-缺氧誘導因子1上調，對氧穩(wěn)態(tài)起重要的調節(jié)和穩(wěn)定作用；化學致癌特征明顯下調。

3.4.3 差異基因的選擇 基于3組比較的差異基因集的韋恩圖如圖9所示，補骨脂素組與對照組有差異的基因集(藍色)中，配伍組與對照無差異(綠色以外)的基因涉及杜仲可能的解毒機制，即藍色區(qū)24個基因和藍色、黃色交界的4個基因。其中涉及毒性的基因gpx1b、pgd、rrm2、gstp2、anpepb、cyp1a、prf1.5值得研究。另外處于韋恩圖中心，3組比較均有差異的基因且涉及毒性的nfκb2(在多種細胞類型中表達，并充當涉及炎癥和免疫功能的基因的中央激活劑)同樣也值得研究。

圖8 各組上調與下調基因的KEGG富集分析

圖9 各組差異基因的選擇

4 討論

斑馬魚與人類基因同源性達87%，其生殖周期短，繁殖能力強，胚胎在母體外發(fā)育從合子期到孵化期僅72 h，且通體透明便于實時靶器官觀察。因此，選擇斑馬魚用于補骨脂的毒性評價及其配伍研究，實驗周期短、成本低，結果可比性強，為中藥毒性和減毒配伍研究提供了良好的工具。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補骨脂安全性受復雜多成分以及成分含量差異變化影響，導致安全性結果差異較大，本文采用具有優(yōu)勢的斑馬魚毒性模型快速評價了不同藥味提取液、不同藥味提取液與補骨脂中毒性明確的有效成分補骨脂素配伍后的毒性差異，避免了因藥材批次、產地、不同提取方法等原因導致成分變化而引起的結果差異。斑馬魚毒性評價結果表明杜仲、桑寄生、女貞子提取液自身對斑馬魚影響較小，分別與補骨脂素配伍后，可明顯改善魚臟器變形，降低死亡率，有顯著減毒效果，其中以杜仲結果最優(yōu)。進一步對杜仲中活性成分桃葉珊瑚苷與補骨脂素配伍進行研究。

對于RNA-Seq富集結果，當補骨脂素與對照組進行比較時，從轉錄組測序所獲得的結果有支持毒性、疾病(癌癥)、炎癥、免疫激活、藥物代謝等方面的負面影響。而加入桃葉珊瑚苷配伍后與原有的單一補骨脂素組相比，不僅在毒性、疾病(癌癥)、免疫激活方面有明顯的減少，并在神經營養(yǎng)因子、長壽調節(jié)、血小板激活信號通路方面有明顯的增強，同時，化學致癌特征信號通路出現(xiàn)了下降。這說明配伍可以起到一定的減毒效果，雖然如此，基于轉錄組分析的減毒具體機制仍然需要進行后續(xù)驗證。但RNA-Seq大致指明了杜仲配伍補骨脂后減毒機制的研究方向，后續(xù)可以對長壽調節(jié)通路、HIF-1通路、化學致癌通路、谷胱甘肽代謝通路進一步探討驗證杜仲配伍后的減毒機制，并對篩選的基因轉錄后的mRNA進行qPCR驗證，以及相關蛋白進行檢測以進一步闡明解毒機制。

有效組分配伍不僅有傳統(tǒng)配伍整體觀,且存在有效組分明確的優(yōu)勢,其“配伍藝術”與“精準藥物”相結合的巨大潛力,必將成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的關鍵點、突破點。注重加強對中藥有效組分的配伍減毒的研究,對臨床遣藥組方，降低臨床毒副作用，提高用藥安全性有重要的指導意義。本文后續(xù)將對其配伍減毒的相關機制開展進一步的研究。