柔肝化纖顆粒對代償期乙肝肝硬化肝腎陰虛型患者外周血NLRP3炎癥小體及其產(chǎn)物表達的影響

段桂姣，王振常，蔣銳沅，郝薔薇，呂艷杭，農(nóng)小欣

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530299；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530001)

乙肝肝硬化是由于乙型肝炎病毒(HBV)感染導(dǎo)致肝內(nèi)淋巴細胞增加，產(chǎn)生大量細胞因子及炎癥介質(zhì)，肝細胞變性壞死，引起結(jié)締組織增生、假小葉形成的一種病理變化。我國屬慢性肝病大國，其中慢性乙肝患者占3 000萬人，約30%可發(fā)展為肝硬化，若治療不及時可出現(xiàn)上消化道出血等并發(fā)癥，嚴(yán)重危及患者生命[1]。恩替卡韋能有效抑制HBV的復(fù)制，減少肝臟炎癥的損傷，但在抗肝纖維化方面作用不顯著[2-3]。因此如何有效防治乙肝肝硬化的進展已成為臨床的重點及難點問題。實驗研究發(fā)現(xiàn)，減輕肝臟炎癥反應(yīng)是逆轉(zhuǎn)肝纖維化、延緩肝病進展的重要措施[4]。目前乙肝肝硬化外周血中核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(Nucleotide oligomerization structural domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體的表達水平與肝臟炎癥因子的關(guān)系還有待深入研究。本研究通過觀察柔肝化纖顆粒聯(lián)合恩替卡韋對代償期乙肝肝硬化肝腎陰虛型患者的臨床療效和NLRP3炎癥小體及其產(chǎn)物影響,探索中西醫(yī)聯(lián)合治療代償期乙肝肝硬化的有效途徑。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院門診2017年12月至2019年12月治療的80例代償期乙肝肝硬化肝腎陰虛型患者，隨機分為治療組和對照組各40例。其中對照組男27例，女13例；年齡18～70歲，平均年齡(40.53±9.08)歲；病程1～16 a，平均病程(8.71±2.91)a；Child-Pugh評分(8.18±1.28)分。治療組男22例，女18例；年齡18～65歲，平均年齡(40.62±9.12)歲；病程1～15 a，平均病程(8.73±3.01)a；Child-Pugh評分(8.08±1.21)分。2組患者性別、年齡、病程、Child-Pugh評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2組具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號：KY20170110)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 2組患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[5]及《肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)：①HBsAg、HBV-DNA陽性6個月以上；②HBeAg陽性、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotrans,ALT)持續(xù)或反復(fù)異常；③瞬時彈性成像(Transientelastography，TE)檢測肝臟硬度值≥17.5 kPa；④符合HBV感染抗病毒的適應(yīng)證；⑤表現(xiàn)輕度乏力, 食欲減少或腹脹、腹瀉、上腹隱痛等癥狀；⑥Child-Pugh分級為A級；⑦B超提示肝臟腫大，形態(tài)失常，表面欠平整，且各切面、徑線也有增大等表現(xiàn)。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 2組患者均符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]中“癥積-肝腎陰虛證”主癥：①腰酸腿痛；②脅肋隱痛；③五心煩熱。次癥：①耳鳴耳聾；②頭暈眼花；③口干咽燥。舌紅少苔，脈細或細數(shù)。同時具備2項主癥或2項主癥伴隨1項次癥，同時結(jié)合舌脈，由2名副主任及以上級別中醫(yī)醫(yī)師可確診為此證。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述西醫(yī)及中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡在18～70周歲；③入組患者為乙肝肝硬化代償期；④近6個月內(nèi)未服用任何抗病毒、抗肝纖維化及免疫調(diào)節(jié)劑；⑤患者自愿參加,并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他臟器功能損害者，或有精神疾病、甲型及丙型肝炎病史者；②孕婦、哺乳期或備孕計劃者；③已知對本次所用藥物過敏者。

1.4 脫落及剔除標(biāo)準(zhǔn)

①未按照實驗方案用藥或中途改用其他藥物治療者；②未能完成實驗方案或中途退出者；③治療期間出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)者。

2 方法

2.1 治療方法

對照組：根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》[5]予空腹口服恩替卡韋分散片(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，0.5 mg/片)，0.5 mg/次，1次/d。

治療組：在對照組治療基礎(chǔ)上，加用柔肝化纖顆粒治療。藥用黃芪15 g,薏苡仁15 g,黃精30 g,枸杞子30 g,大棗20 g，牡蠣20 g，鱉甲15 g，澤蘭20 g，雞內(nèi)金10 g，橘紅10 g，虎杖20 g，牡丹皮20 g。由我院制劑室制備成免煎顆粒，每日1劑，兌溫水沖服200 mL,早晚飯后分服。

2組療程均為24周。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 中醫(yī)證候積分 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]中乙肝肝硬化肝腎陰虛型證候標(biāo)準(zhǔn),主癥腰酸腿痛、脅肋隱痛、五心煩熱。次癥耳鳴耳聾、頭暈眼花、口干咽燥。根據(jù)病情無、輕、中、重標(biāo)準(zhǔn)分別積分,制定中醫(yī)證候積分量表。其中無自覺癥狀記0分；癥狀較輕,能日常生活記1分；癥狀中等,影響部分日常生活記2分；癥狀較重,不能堅持正常工作記3分。積分越高,癥狀越重。

2.2.2 臨床療效評價 參考文獻[7]制定。尼莫地平法計算，療效指數(shù)=(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100% 。治愈：臨床療效消失或基本消失，肝功能基本正常，肝纖維化指標(biāo)較前下降>75%；顯效：臨床癥狀明顯改善，肝功能恢復(fù)正常，肝纖維化指標(biāo)較治療前下降>50%，≤75%；有效：臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，肝功能接近正?；蜉^治療前下降>25%，肝纖維化指標(biāo)較治療前下降>25%，≤50%；無效：未達有效標(biāo)準(zhǔn)或惡化。

2.2.3 實驗室指標(biāo)測定 治療前后采集2組患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，KH20R-Ⅱ型低溫冷凍離心機(湖南凱達科學(xué)儀器有限公司)以3 000 r/min離心10 min取血清，分裝保存于-80 ℃冰箱待用。

(1)肝功能和肝纖維化指標(biāo)檢測。采用ELISA法檢測血清ALT、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Asprtate transaminase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)、總膽紅素(Total bilirubin,TBIL)水平。試劑盒由上海透景診斷科技有限公司提供，檢測儀器為BK-400型全自動生化分析儀(武漢科爾達醫(yī)療科技有限公司)。

采用ELISA法測定血清Ⅲ型前膠原(Procoagen typeⅢ protein, PC-Ⅲ)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ,Ⅳ-C)、層黏蛋白(Laninin,LN)、透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)水平。試劑盒由上海拜力生物科技有限公司提供，檢測儀器為AE-180型全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)。具體操作均嚴(yán)格按照說明書進行。

(2)HBV-DNA水平檢測。采用熒光定量PCR法檢測并比較治療前后患者HBV-DNA水平。HBV-DNA定量檢測試劑盒(貨號：3400175)由中山醫(yī)科大學(xué)達安基因股份有限公司提供，檢測儀器為LightCycler480II熒光定量PCR儀(上海智巖科學(xué)儀器有限公司)，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

(3)炎性因子水平檢測。采用ELISA法檢測外周血IL-1β、IL-18及TNF-α表達水平。將待測血清每孔加入100 μL，分別加入生物素標(biāo)記抗體、過氧化物酶標(biāo)記親和素、底物溶液及終止液充分反應(yīng)后，于5 min內(nèi)在450 nm波長Varioskan LUX型酶標(biāo)儀(南京德鐵實驗設(shè)備有限公司)中檢測。試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，操作嚴(yán)格按照說明書進行。

(4)血清NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA水平檢測。運用Trizol法提取患者總RNA，測定RNA濃度，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司提供，貨號：RR036A)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。結(jié)果分析：以GAPDH為內(nèi)參，熒光定量PCR法檢測各基因mRNA的表達量。計算各組相應(yīng)基因的2-ΔΔCT值。以目的基因的量為定量結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR實驗所用引物序列

2.2.4 肝脾影像學(xué)檢查 治療前后采用DW-T5型彩色多普勒超聲儀(江蘇大為醫(yī)療有限公司)檢測患者脾厚度、門靜脈內(nèi)徑(Dpv)、脾靜脈內(nèi)徑(Dsv)。

2.2.5 安全性評價 治療前后入院患者分別檢測血常規(guī)、尿常規(guī)、糞便常規(guī)、肝腎功能、心電圖等項目。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較

結(jié)果見表2。

表2 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較

3.2 2組患者治療前后肝功能指標(biāo)比較

結(jié)果見表3。

表3 2組患者治療前后肝功能指標(biāo)比較

3.3 2組患者治療前后肝纖四項水平比較

結(jié)果見表4。

表4 2組患者治療前后肝纖四項水平比較

3.4 2組患者治療前后肝脾影像學(xué)指標(biāo)及血清HBV-DNA水平比較

結(jié)果見表5。

表5 2組患者治療前后脾厚度、Dpv、Dsv及血清HBV-DNA水平比較

3.5 2組患者治療前后血清IL-1β、IL-18及TNF-α水平比較

結(jié)果見表6。

表6 2組患者治療前后血清IL-1β、IL-18及TNF-α水平比較

3.6 2組患者治療前后NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表達水平比較

結(jié)果見表7。

表7 2組患者治療前后NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表達比較

3.7 2組患者臨床療效比較

結(jié)果見表8。

表8 2組患者臨床療效比較(n=40)

3.8 2組患者安全性評價

治療期間，對照組出現(xiàn)1例腹瀉，未予處理，2 d后癥狀自行消失；其他患者三大常規(guī)、肝腎功能、心電圖均無異常表現(xiàn)。

4 討論

乙肝肝硬化歸屬于中醫(yī)學(xué) “鼓脹”范疇。其主要病理為進行性的肝纖維化。肝纖維化與機體罹患病毒性肝炎、免疫功能紊亂、炎癥因子刺激、酒精中毒、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素有關(guān)。因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療以抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗肝纖維化、抗炎及積極預(yù)防并發(fā)癥為主。

乙肝肝硬化大多起病隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，容易錯過最佳治療時間。大量研究證實，NLRP3炎癥小體是肝臟炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過激活Caspase-1導(dǎo)致IL-1β、IL-18等促炎細胞因子過分泌，引起機體炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)肝纖維化的形成[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性肝損傷過程中伴隨著NLRP3炎癥小體及其相關(guān)促炎因子mRNA和蛋白表達水平的上升[9]。同時研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷過程中活化的炎癥小體能引起正常肝細胞焦亡，加重肝損程度及機體炎癥反應(yīng)[10]?？梢?，抑制炎癥小體的活化在治療慢性肝病中意義重大。

多項研究證實，中醫(yī)藥能抑制乙肝病毒復(fù)制水平、延緩肝纖維化進展、多途徑干預(yù)治療肝硬化[11]。導(dǎo)師王振常教授認為機體正虛，濕熱疫毒之邪凝聚肝經(jīng)，出現(xiàn)肝氣郁結(jié)，氣滯血瘀，濕熱凝聚成痰，阻滯肝脈血絡(luò)，肝失疏泄可克脾土，脾之運化不暢可克腎水，最終導(dǎo)致肝腎陰虛。這與著名肝病大家關(guān)幼波教授對鼓脹的認識相一致[12]。因此，柔肝健脾補腎的同時，還應(yīng)兼顧滋陰。

柔肝化纖顆粒是導(dǎo)師王振常教授在全國名老中醫(yī)林沛湘教授治療慢性肝炎、肝炎肝硬化的有效經(jīng)驗方“壯肝逐瘀煎”原方進行拆分分組，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化其配伍而來[13]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，在治療乙肝肝硬化及肝纖維化患者中加用柔肝化纖顆粒，能有效改善肝功能及臨床療效，降低肝臟炎癥反應(yīng)[14-16]。柔肝化纖顆粒由黃芪、薏苡仁、黃精、枸杞子、大棗、牡蠣、鱉甲、澤蘭、雞內(nèi)金、橘紅、虎杖、牡丹皮組成。方中黃芪益氣固表止汗，為補氣升陽之要藥；黃精健脾益腎，補氣滋陰；枸杞子滋補肝腎，三藥合用養(yǎng)肝腎，補肝陰。牡蠣、鱉甲滋陰潛陽、軟堅散結(jié)，二藥滋水涵木，使肝木和，腎水調(diào)。薏苡仁、橘紅、雞內(nèi)金、大棗健脾，四藥合用健脾益氣、燥濕化痰。澤蘭、虎杖、牡丹皮活血化瘀、清熱解毒。全方共奏補肝腎、活血化瘀、軟堅化痰之功。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪甲苷通過抑制NLRP3炎癥小體下游因子IL-1β表達，降低炎癥反應(yīng)[17]。薏苡仁蛋白調(diào)控IκK/NF-κB信號通路的活化，降低炎癥反應(yīng)[18]。黃精、枸杞子能提高機體免疫力、抗腫瘤。大棗多糖能抑制促炎因子IL-6表達，起到抗炎的作用[19]。牡蠣、澤蘭、虎杖、牡丹皮、雞內(nèi)金、橘紅、鱉甲具有提高免疫力、抗病毒、抗炎等多種藥理學(xué)作用[20-22]。

最新研究表明[23]通過抑制NLRP3炎性小體的活化，能有效抑制其下游因子的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，改善炎癥相關(guān)性疾病的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，治療組血清NLRP3 炎癥小體及其產(chǎn)物IL-1β、Caspase-1、IL-18 水平均較對照組顯著下降，提示柔肝化纖顆粒輔助治療療效顯著，可能是其通過未知的相關(guān)炎癥因子介導(dǎo)免疫穩(wěn)態(tài)。因此，進一步深入研究NLRP3炎癥小體及其下游炎癥效應(yīng)因子在慢性肝炎、肝硬化的形成過程中的作用機制刻不容緩。同時，彩超結(jié)果顯示Dpv、Dsv、脾厚度均下降，提示聯(lián)合用藥可使Dpv、Dsv縮小，脾臟回縮。HBV-DNA水平明顯降低，提示聯(lián)合用藥能有效抑制HBV多聚酶活性及復(fù)制。治療后ALT、AST、TBIL水平及肝纖維化指標(biāo)均顯著下降，ALB水平升高，表明聯(lián)合柔肝化纖顆粒能明顯改善肝臟功能、肝纖四項水平，一定程度逆轉(zhuǎn)早期肝硬化的進展。

綜上所述，柔肝化纖顆粒治療乙肝肝硬化療效明確，能有效改善肝功能，提高HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率水平，降低Dpv、Dsv、脾厚度，其作用機制可能是通過抑制血清NLRP3炎癥小體表達及下游炎性因子活化、分泌，減輕肝細胞受損程度，減輕機體炎癥反應(yīng)。血清NLRP3炎癥小體、Caspase-1及下游炎性因子IL-1β、IL-18在參與慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中意義重大, 但具體機制有待進一步研究。