槲皮素復(fù)合益生元固體飲料的研制及其對(duì)小鼠腸道菌群的影響研究

曾鈺鵬，李國(guó)坤，盧曉丹，丁靜華，蘇立杰，陳驍熠

（廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 511436）

腸道是人體重要器官，對(duì)維持健康生命活動(dòng)具有重要意義。由于不良的飲食習(xí)慣和生活作息，腸道疾病如便秘、炎性腸病等發(fā)病率越來(lái)越高且趨于年輕化［1，2］，而腸道疾病長(zhǎng)期發(fā)展下去不僅會(huì)誘發(fā)肥胖、高血壓［3］、代謝性疾?。?］，還會(huì)導(dǎo)致腸道癌癥［5］。腸道疾病常常是由腸道的炎癥和腸道菌群的紊亂引起的［6］，抑制腸道炎癥和調(diào)節(jié)腸道菌群是治療腸道疾病的關(guān)鍵，而常規(guī)的藥物治療副作用大，且疾病易復(fù)發(fā)，通過(guò)膳食中的天然活性物質(zhì)抑制腸道炎癥和調(diào)節(jié)腸道菌群［7］，為有效預(yù)防和治療腸道疾病提供新思路。

槲皮素（Quercetin）被認(rèn)為是預(yù)防和治療多種慢性疾病的一種重要天然活性物質(zhì)，其來(lái)源廣泛［8］且提取簡(jiǎn)單，不僅具有抗氧化、抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及保護(hù)心血管等作用［9］，還對(duì)腸道菌群有調(diào)節(jié)作用。槲皮素能改善微生物多樣性減少趨勢(shì)，增強(qiáng)潛在有益微生物豐度［10］，調(diào)節(jié)腸道菌群失衡狀態(tài)，促進(jìn)宿主恢復(fù)微生物平衡。另外，槲皮素具有保護(hù)腸屏障的作用［11］，通過(guò)抑制腸道細(xì)菌脂多糖的產(chǎn)生，減少脂多糖對(duì)腸屏障的刺激，從而降低炎癥反應(yīng)。雖然槲皮素對(duì)人體健康具有多種有益作用，但中國(guó)居民槲皮素每日人均攝入量不超過(guò)10 mg［12］，無(wú)法達(dá)到理想的保健效果，因此研制槲皮素功能食品具有重要意義。

槲皮素雖然能有效抑制有害菌的生長(zhǎng)［13］，但對(duì)有益細(xì)菌生長(zhǎng)的增殖作用不如益生元顯著。而低聚果糖（Fructo oligosaccharide，F(xiàn)OS）作為一種常見(jiàn)的益生元，不僅能有效促進(jìn)雙歧桿菌［14］、乳桿菌［15］的增殖，還能抑制腸桿菌［16］、產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌生長(zhǎng)，從而靶向調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，達(dá)到調(diào)整腸道微生態(tài)［17］、預(yù)防腸道感染、改善排便等作用。另外，低聚果糖還具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能、抗過(guò)敏、促進(jìn)礦物元素吸收、降低血液膽固醇及血脂濃度、減少腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等多種功能［18］，是理想的保健食品。因此將槲皮素和低聚果糖復(fù)合，使其對(duì)腸道有害菌生長(zhǎng)的抑制作用更加明顯，對(duì)有益菌生長(zhǎng)的扶植作用更加有效。

目前，關(guān)于槲皮素功能食品研發(fā)的報(bào)導(dǎo)非常少，以槲皮素和低聚果糖為原料，研制一款槲皮素復(fù)合益生元固體飲料，使該固體飲料既具有改善腸道健康的功能，又為槲皮素補(bǔ)充提供一個(gè)新渠道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素，西安天豐生物科技股份有限公司；低聚果糖、羧甲基纖維素（Carboxymethyl cellulose，CMC）、檸檬酸，市售食品級(jí)；乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海瑞豐儀器儀表有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；迅數(shù)自動(dòng)菌落分析儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；電子天平，普利賽斯科學(xué)儀器有限公司；MULTISKAN GO全自動(dòng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 主要工藝流程 配料→過(guò)篩→混合→檢驗(yàn)→包裝→成品。

1.3.2 槲皮素復(fù)合益生元固體飲料的感官評(píng)分 標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定小組由10人組成，根據(jù)色澤、組織形態(tài)、氣味、滋味4方面進(jìn)行綜合評(píng)分，總分為100分，其中色澤、組織狀態(tài)、氣味、滋味各占25%。按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各個(gè)配方結(jié)果打分，取平均值作為最終分?jǐn)?shù)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 配方優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，對(duì)低聚果糖添加量、槲皮素添加量、檸檬酸添加量和羧甲基纖維素鈉添加量進(jìn)行考察，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)選擇最優(yōu)配方。

1.3.4 產(chǎn)品檢驗(yàn) 水分檢測(cè)參照GB 5009.3《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》第一法直接干燥法；參照GB/T 4789《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》檢測(cè)固體飲料中的菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母。

1.3.5 槲皮素復(fù)合益生元固體飲料對(duì)小鼠部分腸道菌群的影響 分別探討低聚果糖、槲皮素和最佳配方固體飲料對(duì)小鼠部分腸道菌群的影響。選取腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌4類細(xì)菌作為研究對(duì)象，這4類細(xì)菌也是《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》中用于評(píng)價(jià)受試樣品是否具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用細(xì)菌。

1）選擇培養(yǎng)基的配制。按照培養(yǎng)基配制方法分別配制膽汁七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌選擇培養(yǎng)基、乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基。

2）樣本的稀釋及細(xì)菌培養(yǎng)條件的確定。無(wú)菌取小鼠糞便，用無(wú)菌水梯度稀釋至10-4后，分別接種于對(duì)應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件見(jiàn)表2。選擇性培養(yǎng)并鑒定，剔除不符合條件的菌落，其余菌落以無(wú)菌水沖洗后收集，得到目標(biāo)菌種。

表2 細(xì)菌培養(yǎng)條件

3）菌落的鑒定。參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版對(duì)腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌的描述，對(duì)分離所得菌種菌落形態(tài)和微生物形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定。

4）光電比濁法測(cè)定吸光度（OD）。將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊哪繕?biāo)菌種（腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌）以10%的接種量接種于含有適量樣品的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，取200 μL置于96孔板中，37℃厭氧培養(yǎng)。以空白營(yíng)養(yǎng)肉湯為對(duì)照，分別做3個(gè)平行樣，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度（OD600nm）。每2 h測(cè)定1次，共檢測(cè)24 h。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 低聚果糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響 以40℃溫水100 mL沖調(diào)，固定槲皮素0.4 g、檸檬酸0.05 g、CMC 0.15 g，探究低聚果糖添加量為 4、6、8、10、12 g對(duì)產(chǎn)品感官質(zhì)量的影響，感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)在低聚果糖添加量為8 g時(shí)，感官評(píng)分最高，說(shuō)明在該條件下，飲料酸甜可口、口感最佳。

圖1 低聚果糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.2 槲皮素添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響 以40℃溫水100 mL沖調(diào)，固定低聚果糖8 g、檸檬酸0.05 g、CMC 0.15 g，探究槲皮素添加量為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g對(duì)產(chǎn)品感官質(zhì)量的影響，感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)在槲皮素添加量為0.4 g時(shí)，感官評(píng)分最高，槲皮素添加量少時(shí)，產(chǎn)品槲皮素清香不明顯；添加量大時(shí)，飲料的色澤、口感皆變差。

圖2 槲皮素添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.3 檸檬酸添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響 以40℃溫水100 mL沖調(diào)，固定低聚果糖8 g、槲皮素0.4 g、CMC 0.15 g，探究檸檬酸添加量為 0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g對(duì)產(chǎn)品感官質(zhì)量的影響，感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)在檸檬酸添加量為0.05 g時(shí)，感官評(píng)分最高，說(shuō)明此時(shí)酸味與甜味恰到好處、味道和諧，添加量過(guò)高或過(guò)低皆會(huì)導(dǎo)致滋味不佳。

圖3 檸檬酸添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.4 CMC添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響 以40℃溫水100 mL沖調(diào)，固定低聚果糖8 g、槲皮素0.4 g、檸檬酸0.05 g，探究CMC添加量為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g對(duì)產(chǎn)品感官質(zhì)量的影響，感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)在CMC添加量為0.15 g時(shí)，感官評(píng)分最高，說(shuō)明此時(shí)產(chǎn)品乳化效果、穩(wěn)定性最佳，口感最好。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按40℃溫水100 mL沖調(diào)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，選取低聚果糖添加量、槲皮素添加量、檸檬酸添加量和羧甲基纖維素添加量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，各因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響存在差異，影響大小依次為低聚果糖添加量（A）＞槲皮素添加量（B）＞檸檬酸添加量（C）＞羧甲基纖維素添加量（D），極差分析結(jié)果表明最優(yōu)方案為A2B2C3D2，即低聚果糖添加量8 g，槲皮素添加量0.4 g，檸檬酸添加量0.06 g，羧甲基纖維素添加量0.15 g。

圖4 CMC添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

表3 正交試驗(yàn)因素與水平

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 產(chǎn)品檢驗(yàn)

產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 相關(guān)產(chǎn)品檢驗(yàn)

2.4 菌種鑒定結(jié)果

如圖5所示，腸球菌革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌落較小、圓形、表面光滑、不透明，周圍有褐色圈；腸桿菌革蘭氏染色為陰性，菌落中等大小、紫黑色、有金屬光澤，菌落呈圓形；雙歧桿菌革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌落中等大小、瓷白色、邊緣整齊光滑，菌落呈圓形；乳桿菌革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌落中等大小、凸起、微白色，菌落呈圓形。

圖5 菌種菌落形態(tài)

2.5 槲皮素復(fù)合益生元固體飲料對(duì)腸道菌群體外增殖的影響

按照正交試驗(yàn)得到的最佳配方用100 mL水沖調(diào)后，按照10%的添加量加入營(yíng)養(yǎng)肉湯，接種目標(biāo)菌后，通過(guò)光電比濁法測(cè)定OD值，研究固體飲料的主要原料低聚果糖和槲皮素，以及最佳配方固體飲料對(duì)腸道菌群體外增殖的影響。

2.5.1 對(duì)腸球菌體外增殖的影響 如圖6所示，低聚果糖、槲皮素和10%飲料組的OD值沒(méi)有空白組的增幅大，且都在16 h達(dá)到平緩，說(shuō)明低聚果糖、槲皮素和槲皮素復(fù)合益生元固體飲料都對(duì)腸球菌的增殖有抑制作用。

圖6 低聚果糖、槲皮素和固體飲料對(duì)腸球菌的增殖影響

2.5.2 對(duì)腸桿菌體外增殖的影響 如圖7所示，低聚果糖、槲皮素和10%飲料組的OD值在6 h后增幅減小且趨于平緩，而空白組OD值增幅沒(méi)有明顯減小趨勢(shì)，說(shuō)明低聚果糖、槲皮素和槲皮素復(fù)合固體飲料對(duì)腸桿菌的增殖有抑制作用。

圖7 低聚果糖、槲皮素和固體飲料對(duì)腸桿菌的增殖影響

2.5.3 對(duì)雙歧桿菌體外增殖的影響 如圖8所示，低聚果糖組平緩期OD值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白組，槲皮素組平緩期OD值低于空白組，而槲皮素復(fù)合固體飲料平緩期OD值高于空白組，說(shuō)明槲皮素復(fù)合固體飲料對(duì)雙歧桿菌的增殖有促進(jìn)作用。

圖8 低聚果糖、槲皮素和固體飲料對(duì)雙歧桿菌的增殖影響

2.5.4 對(duì)乳桿菌體外增殖的影響 如圖9所示，低聚果糖組平緩期OD值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白組，槲皮素組平緩期OD值低于空白組，而槲皮素復(fù)合固體飲料平緩期OD值高于空白組，說(shuō)明槲皮素復(fù)合固體飲料對(duì)雙歧桿菌的增殖有促進(jìn)作用。

圖9 低聚果糖、槲皮素和固體飲料對(duì)乳桿菌的增殖影響

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定槲皮素復(fù)合益生元固體飲料的最佳配方為低聚果糖添加量8 g、槲皮素添加量0.4 g、檸檬酸添加量0.06 g、羧甲基纖維素添加量0.15 g，沖調(diào)水為100 mL；最佳配方所得槲皮素復(fù)合益生元固體飲料能明顯抑制腸球菌和腸桿菌的增殖，也能有效促進(jìn)雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，為槲皮素功能食品的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。