生大黃與清蒸大黃的大承氣湯對血清內(nèi)毒素、NO和TNF-α含量變化的影響

楊桂林，劉承統(tǒng)，曾海生，何思陸，周歧驥，莫昕瑩，陳冬蓮，陸玉丹

（右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000）

大承氣湯始載于漢代張仲景的《傷寒論》和《金匱要略》，由大黃、枳實、厚樸和芒硝組成，是瀉法的代表方劑［1，2］，其具有瀉下熱結(jié)的作用，主治陽明腑實證和里熱實證等［3］。目前臨床上主要用于治療急腹癥、腸梗阻與胃腸道功能障礙等疾病，此外，該方劑在輔助改善腦血管病人意識、有機磷農(nóng)藥急性中毒搶救等方面也有很好的療效［4，5］。研究表明，其具有瀉下、降低炎性細胞因子、抑制血清內(nèi)毒素、抗炎、提高機體免疫力和調(diào)節(jié)胃腸激素分泌等藥理作用，對腦、肺等臟器具有明顯的保護作用。大黃在大承氣湯方劑中作君藥，其安全性則由組成復方的中藥決定，中藥炮制后藥性改變，毒副作用降低［6］。

大黃經(jīng)過不同的方法炮制，其化學成分及其藥效變化差異很大，甚至產(chǎn)生相反的藥效［7］。目前報道的大多是大黃與多味藥配伍前后藥效的變化［8，9］，不能證明大黃不同炮制品與多味藥配伍后其瀉下功效的改變及在不同配伍中體現(xiàn)的共性關系。本試驗主要研究生大黃與清蒸大黃的大承氣湯對ABP小鼠體內(nèi)內(nèi)毒素和NO的影響以及對炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-α）的干擾，嘗試說明大承氣湯對其的作用與相關機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV-1800型紫外分光光度計（日本島津公司）；全波長酶標儀（美國BIOTEK-Epoch）；低溫離心機（上海安亭科學儀器廠）；PRACTUM224-KN SOP電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；離心機（德國Thermo Fisher）；水浴鍋（上海一恒公司，HWS12）；旋渦混合器。

1.1.2 藥物與試劑 顯色基質(zhì)鱟試劑盒（廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：180525）；氨芐西林膠囊（聯(lián)邦制藥廠有限公司，批號：20300）；一氧化氮（NO）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180406）；炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-α）（南京建成生物工程研究所，批號2018/06）；生理鹽水（貴州天地藥業(yè)有限責任公司，批號：H18051906）；試驗用水為純水。

1.1.3 藥材 中藥飲片大黃（產(chǎn)地：四川，批號170307002）、枳實（產(chǎn)地：江西，批號170101773）、姜厚樸（產(chǎn)地：陜西，批號 170507021）、芒硝（產(chǎn)地：青海，批號170307612）。生大黃、枳實、厚樸及芒硝購于廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室李斌副教授鑒定，中藥大黃為蓼科植物藥用大黃（Rheum officinaleBaill.）的干燥根和根莖，枳實為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantiumL.）的干燥幼果，厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalisRehd.et Wils.）或凹葉厚樸（Magnolia officinalisRe?hd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，以上3味中藥粉碎過10目篩。芒硝，中藥名，經(jīng)鑒定為硫酸鹽類礦物芒硝族芒硝，為結(jié)晶體，主要含十水硫酸鈉（Na2SO4·10H2O）。

1.1.4 動物 清潔級昆明小鼠，體量（20±2）g，雌雄對半。動物質(zhì)量合格證號：0001757，生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002，均由廣西醫(yī)科大學試驗動物中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗藥液提取 采用上述藥材，按處方比例取厚樸藥材粉末24 g，枳實12 g，大黃12 g，芒硝9 g，厚樸與枳實加純水500 mL浸泡30 min，加熱煮沸后保持微沸30 min，用500目濾布過濾，剩下的藥渣再加純水500 mL后浸泡30 min，然后加熱煮沸保持微沸30 min，再過濾，合并兩次濾液，然后加入大黃粉末，浸泡20 min后，再加熱煮沸，保持微沸20 min，用500目濾布過濾，藥渣再加入純水300 mL，加熱煮沸后保持微沸20 min，過濾，合并濾液，趁熱加入芒硝，攪拌使溶解，濃縮成濃度為0.3∶1的藥液（含生藥0.3 g/mL），置于2～8℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

同“1.2.1”項制備藥液方法，將藥液濃縮成濃度為0.5∶1的藥液（含生藥0.5 g/mL），置于2～8℃冰箱儲存?zhèn)溆?。生大黃的大承氣湯記為生DCQT，清蒸大黃的大承氣湯記為清蒸DCQT。

1.2.2 ABP小鼠動物模型的建立 參考文獻［10］以及結(jié)合預試驗，隨機選取15只健康小鼠為正常對照組，腹腔注射氯化鈉注射液0.5 mL/只。取小鼠糞便6 g，加入100 mL生理鹽水，研磨均勻，靜置30 min，取上層混懸液，腹腔注射，0.5 mL/只；腹腔注射后20 h，小鼠出現(xiàn)眼角分泌物濃稠、口唇發(fā)紫、少動、豎毛、蜷曲蹲伏、腹部鼓脹、不進食和大便極干等癥狀。解剖腹腔可見腹腔內(nèi)有少量渾濁液體，多數(shù)腸管膨脹，腸管充血，部分腸管痙攣，即表示造模成功。在臨床上可出現(xiàn)陽明腑實證，需用寒下法通里攻之。

1.2.3 分組給藥 取體重為（20±2）g健康小鼠105只，雌雄各半，小鼠適應性喂養(yǎng)4 d后，隨機分組，每組15只，分為以下7組：①生DCQT 6、10 g/kg劑量組；②清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組；③空白對照組；④模型組；⑤陽性對照組（氨芐西林，20 mL/kg體重，60 mg/mL）。

DCQT不同劑量組在造模成功后給藥，連續(xù)2 d，1次/d。

陽性對照組給予氨芐西林，濃度60 mg/mL，20 mL/kg體重，造模成功后給藥，連續(xù)2 d，1次/d。

空白對照組，20 mL/kg體重，腹腔注射生理鹽水20 h后給予去離子水灌胃，連續(xù)2 d，1次/d。

模型組，20 mL/kg體重，造模成功后給予去離子水灌胃，連續(xù)2 d，1次/d。

給藥后測定小鼠血清內(nèi)毒素、NO和腫瘤壞死因子（TNF-ɑ）的含量。

1.2.4 血清內(nèi)毒素含量測定 各實驗動物組在造模成功42 h后，吸取鱟試劑檢測配套的血液抗凝劑于無熱源試管中，在無菌操作下進行眼球取血，血液放到無熱源試管中與抗凝劑混勻，置冰水中，加蓋，低溫離心（3 000 r/min，10 min），精密吸取適量上清液，用內(nèi)毒素檢查用水配制成2倍稀釋液儲存?zhèn)溆?。?倍稀釋液0.2 mL加入到0.8 mL樣本處理液，混勻，制成10倍稀釋液備用。將10倍稀釋液于70℃恒溫水浴中加熱10 min（水浴加熱需要封閉管口以避免水珠流入樣品中），將加熱后的10倍稀釋液用冰水浴冷卻后，在常溫條件下離心（3 000 r/min，10 min），取上清液檢測，檢測步驟見顯色基質(zhì)鱟試劑盒說明書。以鱟試劑偶氮基質(zhì)顯色法定量測定，結(jié)果以EU/mL表示。

?。?0±2）g健康小鼠 105只，雌雄各半，按“1.2.3”方法隨機分組給藥，按劑量6、10 g/kg，容積20 mL/kg灌胃給藥，腹腔注射小鼠糞液20 h后灌胃給藥，1次/d，連續(xù)2 d。

1.2.5 一氧化氮（NO）含量測定 試驗采用的是硝酸還原酶法，試驗按照試劑盒說明書操作。取（20±2）g健康小鼠105只，雌雄各半，按“1.2.3”方法隨機分組給藥，按劑量6、10 g/kg，容積20 mL/kg給藥，腹腔注射小鼠糞液20 h后灌胃給藥，1次/d，連續(xù)2 d。

1.2.6 炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-α）測定 本試驗采用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾心法，嚴格按照試劑盒說明書操作。?。?0±2）g健康小鼠105只，雌雄各半，按“1.2.3”方法隨機分組給藥，按劑量6、10 g/kg，容積20 mL/kg給藥，腹腔注射小鼠自家糞液20 h后給藥，1次/d，連續(xù)2 d。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 試驗數(shù)據(jù)均以（平均數(shù)±標準差）表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。進行完全隨機設計的多個樣本均數(shù)比較的單因素方差分析，如差異具有顯著性意義，則采用SNK-q檢驗進行多個樣本均數(shù)間多重比較。P＜0.05，則具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)毒素標準溶液配制與標準曲線的制作

細菌內(nèi)毒素標準溶液配制與標準曲線（圖1）的制作參照試劑盒說明書要求：分別加細菌內(nèi)毒素（ET）檢查用水0.00、0.50、0.75、0.90、1.00 mL，陰性對照及稀釋后測得的吸光度數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 內(nèi)毒素（ET）標準曲線溶液

2.2 血清內(nèi)毒素含量測定結(jié)果

由表2可知，生DCQT 10 g/kg劑量組與空白組相比較，其血中內(nèi)毒素含量與空白組相近，無顯著差異（P＞0.05）；生DCQT 6 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組、模型組和陽性組與空白組比較，其與空白組血中內(nèi)毒素含量差異極顯著（P＜0.01）。

表2 大承氣湯對ABP小鼠外周血內(nèi)毒素含量的影響（±S，n=15）

表2 大承氣湯對ABP小鼠外周血內(nèi)毒素含量的影響（±S，n=15）

注：與空白對照組比較，“*”為差異顯著（P＜0.05），“**”為差異極顯著（P＜0.01）；與模型組比較，“●”為差異顯著（P＜0.05），“●●”為差異極顯著（P＜0.01）；與生 DCQT組比較，“△”為差異顯著（P＜0.05），“△△”為差異極顯著（P＜0.01）；與陽性組比較，“#”為差異顯著（P＜0.05），“##”為差異極顯著（P＜0.01）；表3、表4同

組別生DCQT N//只15 15給藥劑量//g/kg 6 10外周血//EU/mL 0.30±0.08**●●##0.16±0.05●●##清蒸DCQT 15 15 6 10 0.32±0.08**●●##0.22±0.08**●●##0.46±0.07**△△0.13±0.04●●△△##0.50±0.08**△△陽性對照組空白對照組模型組15 15 15 1.2

生 DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸 DCQT 6、10 g/kg劑量組和空白組與模型組中內(nèi)毒素含量比較，其與模型組血中內(nèi)毒素含量差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 內(nèi)毒素（ET）標準曲線

空白組與生DCQT 10 g/kg劑量組相比較，其血中內(nèi)毒素含量與空白組相近，無顯著性差異（P＞0.05）；空白組與生DCQT 6 g/kg劑量組相比較，其血中內(nèi)毒素含量與空白組相近，差異不顯著（P＞0.05）；清蒸DCQT 6 g/kg劑量組與生DCQT組中內(nèi)毒素含量比較無顯著差異（P＞0.05）。

與陽性組比較，生DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組和空白組與其血中內(nèi)毒素含量比較，具有極顯著差異（P＜0.01）。

2.3 一氧化氮（NO）含量測定結(jié)果

由表3可知，生DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組、模型組和陽性組與空白組比較，其與空白組血清NO含量都具有極顯著差異（P＜0.01）；生DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組、空白組和陽性組與模型組比較，其與模型組血清NO含量都具有非常顯著性差異（P＜0.01）；清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組與生DCQT組血清NO含量無顯著差異（P＞0.05）；生DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組、空白組和模型組與陽性組比較，其與陽性組小鼠血清NO含量具有極顯著差異（P＜0.01）。

表3 大承氣湯對ABP小鼠血清NO含量的影響（±S，n=15）

表3 大承氣湯對ABP小鼠血清NO含量的影響（±S，n=15）

組別生DCQT N//只15 15給藥劑量//g/kg 6 10 NO//μmol/L 183.52±14.71**●●##286.39±24.28**●●##清蒸DCQT 15 15 6 10 182.81±10.54**●●##287.83±25.07**●●##陽性對照組空白對照組模型組15 15 15 1.2201.03±10.05**●●△△42.57±5.24●●△△##72.26±6.41**△△##

2.4 炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-α）測定結(jié)果

由表4可知，生DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組、模型組和陽性組與空白組比較，其與空白組小鼠血清TNF-α含量都具有極顯著差異（P＜0.01）；生 DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組、空白組和陽性組與模型組比較，其與模型組小鼠血清TNF-ɑ含量都具有極顯著差異（P＜0.01）；清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組與生DCQT組比較，其與生DCQT組小鼠血清TNF-α含量無顯著差異（P＞0.05）；生DCQT 6、10 g/kg劑量組、清蒸DCQT 6、10 g/kg劑量組、空白組和模型組與陽性組比較，其與陽性組小鼠血清TNF-α含量都具有極顯著差異（P＜0.01）。

表4 大承氣湯對ABP小鼠血清TNF-α含量的影響（±S，n=15）

表4 大承氣湯對ABP小鼠血清TNF-α含量的影響（±S，n=15）

組別生DCQT N//只15 15給藥劑量//g/kg 6 10 TNF-α//pg/mL 4.31±0.79**●●##3.97±0.68**●●##清蒸DCQT 15 15 6 10 4.38±0.84**●●##4.06±0.81**●●##陽性對照組空白對照組模型組15 15 15 1.25.90±0.45**●●△△0.54±0.47●●△△##9.22±0.92**△△##

3 小結(jié)

相關研究表明［11］，急性感染性疾病和急腹癥等表現(xiàn)多是內(nèi)毒素生物活性的體現(xiàn)，或者由其誘生的細胞因子與其他炎癥介質(zhì)所致。實熱便秘是陽明腑實證的一種，實熱便秘的致病因素之一即為內(nèi)毒素（ET）。一氧化氮（NO）具有廣泛的生物學活性，廣泛分布于生物體內(nèi)各組織中，它是一種新型生物信使分子，其在腸道內(nèi)導致的多器官功能衰竭綜合征（MODS）發(fā)病過程中起到關鍵作用［12］。腫瘤壞死因子的生成釋放是機體對各種外源性或內(nèi)源性物質(zhì)刺激的反應，內(nèi)毒素是腫瘤壞死因子釋放的物質(zhì)，內(nèi)毒素和腫瘤壞死因子都能對機體造成傷害，兩者結(jié)合能產(chǎn)生協(xié)同之作用［10］。腫瘤壞死因子可通過內(nèi)分泌的作用進入血液循環(huán)，還可通過旁分泌的形式對鄰近腸上皮細胞發(fā)生影響，從而對腸道的屏障功能產(chǎn)生一定的影響［13］。

試驗研究結(jié)果表明，生大黃與清蒸大黃的大承氣湯作用于實熱壅滯的糞性腹膜炎（ABP）小鼠，其血中NO增加、血清內(nèi)毒素和炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-α）顯著降低。相關研究表明［14，15］，降低炎癥介質(zhì)的可能機制總結(jié)為：提高機體免疫力和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力；降低巨噬細胞的活性，繼而減少NO和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生和釋放；能增強胃腸道運動功能，增加腸血流量，降低腸粘膜通透性；保護溶酶體和線粒體膜，防止其損失，維持機體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡；降低機體氧自由基的存在，減少過氧化損傷。