規(guī)?；i場(chǎng)豬源沙門(mén)氏菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

張 海，鄧珊珊，藺俐仲，楊 源，劉 艷，景書(shū)灝，徐春志，袁 林

（1.貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550081；2.貴陽(yáng)市清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽(yáng)551400；3.貴陽(yáng)市草地站，貴州 貴陽(yáng) 550081；4.貴陽(yáng)市息烽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽(yáng) 550300）

沙門(mén)氏菌是廣泛存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的腸桿菌科革蘭氏陰性桿菌[1]。沙門(mén)氏菌能夠引起人和畜禽全身感染和出現(xiàn)菌血癥，引發(fā)傷寒、副傷寒、腹瀉、發(fā)熱和腸道炎癥等癥狀[2]，食用被污染沙門(mén)氏菌的食材還可發(fā)生食物中毒。沙門(mén)氏菌血清型眾多，目前已報(bào)道的血清型有2 000多種，我國(guó)已報(bào)道的血清型有300余種[3]。引起動(dòng)物腹瀉的沙門(mén)氏菌為腸道沙門(mén)氏菌，主要包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌、豬傷寒沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、都柏林沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌等血清型[4]。沙門(mén)氏菌抗原有菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）和莢膜抗原（表面vi抗原）。近年來(lái)，在非洲豬瘟常態(tài)化防控的形勢(shì)下，政府和養(yǎng)殖企業(yè)加大了對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的投入，隨著生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖企業(yè)趨于規(guī)?；?、集約化，仔豬腹瀉的發(fā)生率越來(lái)越高。引起仔豬腹瀉的病因有病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和飼養(yǎng)管理等，其中細(xì)菌性腹瀉的發(fā)病率日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)采集規(guī)?；i場(chǎng)腹瀉仔豬腸內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR檢測(cè)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，以期為豬場(chǎng)腹瀉的防控提供參考。

1 材料

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年3—6月在貴州嘉農(nóng)種豬養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。

1.2 病料

采自貴陽(yáng)市某豬場(chǎng)仔豬腹瀉病例發(fā)病仔豬的腸道內(nèi)容物。

1.3 主要培養(yǎng)基及試劑

2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖，購(gòu)自天根生化科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、BS瓊脂、腸桿菌科生化鑒定管，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 藥敏紙片

青霉素、哌拉西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明、磺胺甲異噁唑、磺胺嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素共12種獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)小鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢

將采集腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物按照常規(guī)劃線分離細(xì)菌的方法接種于鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取細(xì)小、光滑、圓整、無(wú)色透明的菌落在BS培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。把純化后的細(xì)菌接種于血清肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取少量菌液進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，余下菌液備用。

2.2 生化試驗(yàn)

選擇符合沙門(mén)氏菌培養(yǎng)特征和染色特性的純培養(yǎng)物分別接種于生化反應(yīng)管，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

2.3 PCR鑒定

根據(jù)沙門(mén)氏菌invA基因設(shè)計(jì)引物invA-P1：GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；invA-P2：TCATCGCACCGTCAAAGGAACC，預(yù)期擴(kuò)增片段為184 bp，引物由上海英俊公司合成。使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，將提取的細(xì)菌DNA作為模板，建立PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；72 ℃ 延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將鑒定的沙門(mén)氏菌挑菌接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌菌液細(xì)菌菌落（CFU）含量。按照分離的菌株數(shù)進(jìn)行分組，取質(zhì)量在12 g左右的BLAB小鼠，每組9只老鼠。飼養(yǎng)小鼠3 d后開(kāi)始致病性試驗(yàn)，按0.02 mL/g腹腔注射經(jīng)已鑒定純化的沙門(mén)氏菌菌液（4.1×109cfu/mL），對(duì)照組按0.02 mL/g腹腔注射無(wú)菌生理鹽水。接種后將攻毒小鼠隔離飼養(yǎng)，每日觀察小鼠精神狀態(tài)，記錄發(fā)病情況和死亡情況，并剖檢死亡的小鼠，無(wú)菌采集腹瀉及死亡小鼠心、肝、脾等臟器接種至血瓊脂培養(yǎng)基，分離鑒定細(xì)菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，取分離純培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌菌液，用無(wú)菌棉拭子蘸取適量的菌液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，待平板完全吸收后取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抑菌效果判定。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果

腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物劃線培養(yǎng)接種于血瓊脂培養(yǎng)基，挑取單個(gè)群落在BS瓊脂純化培養(yǎng)，結(jié)果在BS瓊脂培養(yǎng)基中可見(jiàn)到光滑圓整、透明、中心為黑色的菌落，見(jiàn)圖1。挑取BS瓊脂培養(yǎng)基上的黑色菌落，按照細(xì)菌染色方法進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果顯示，分離菌為革蘭氏陰性短小桿菌，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 BS瓊脂培養(yǎng)結(jié)果

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

將分離純化的沙門(mén)氏菌培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)分離菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特性和生化試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，判斷分離菌株1為鼠傷寒沙門(mén)氏菌，分離菌株2為豬霍亂沙門(mén)氏菌。

表1 沙門(mén)氏菌生化試驗(yàn)結(jié)果

3.3 沙門(mén)氏菌PCR鑒定結(jié)果

采用細(xì)菌組DNA提取試劑盒分別提取兩株沙門(mén)氏菌基因組DNA，以提取的DNA為模板，進(jìn)行沙門(mén)氏菌invA基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，兩株沙門(mén)氏菌均能擴(kuò)增出特異性目的片段，大小約為184 bp（圖3）。

圖3 沙門(mén)氏菌PCR鑒定結(jié)果

3.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

將分離鑒定的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌培養(yǎng)物分別注射到小鼠腹腔內(nèi)，攻毒注射第1天后試驗(yàn)組均出現(xiàn)精神萎靡、被毛蓬松、食欲減退，對(duì)照組均正常。攻毒第3天后個(gè)別小鼠出現(xiàn)顫栗、少數(shù)出現(xiàn)便血、拉稀，且試驗(yàn)組有小鼠出現(xiàn)死亡。鼠沙門(mén)氏菌攻毒組在攻毒后第6天小鼠全部死亡，豬霍亂沙門(mén)氏菌攻毒組在攻毒后第8天全部死亡。對(duì)照組小鼠全部正常，未出現(xiàn)異常臨床癥狀。死亡小鼠剖檢可見(jiàn)腸道充血，腹腔積水，肝、脾臟有壞死點(diǎn)。表明兩株沙門(mén)氏菌都有較強(qiáng)的致病性。剖檢病死小鼠，無(wú)菌采集小鼠的肝臟和小腸內(nèi)容物，接種于血瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示分離菌與接種的細(xì)菌形態(tài)特征和培養(yǎng)特性均相同。

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離到的2株沙門(mén)氏菌參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示2株沙門(mén)氏菌均對(duì)青霉素、氨芐西林和吡哌酸高度耐藥，對(duì)氧氟沙星、頭孢克洛、鏈霉素和慶大霉素敏感。

4 討論

仔豬腹瀉是生豬養(yǎng)殖過(guò)程中常發(fā)的疾病，危害仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育，常常是多種誘因混合，嚴(yán)重者可導(dǎo)致仔豬發(fā)生死亡。引起仔豬發(fā)生細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌有大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、魏氏梭菌、耶爾森菌等。臨床上發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)，很難區(qū)分細(xì)菌的種類(lèi)，需要借助于實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。常見(jiàn)的診斷技術(shù)有細(xì)菌的傳統(tǒng)分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。細(xì)菌分離鑒定耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁雜、容易出現(xiàn)錯(cuò)漏，需要專業(yè)的技術(shù)人員開(kāi)展。血清學(xué)檢測(cè)常用的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）抗體檢測(cè)技術(shù)，雖然步驟簡(jiǎn)單、用時(shí)短，但是沙門(mén)氏菌血清型眾多，很難區(qū)分具體的血清型。分子生物學(xué)中常用的方法是PCR和熒光PCR檢測(cè)方法，熒光PCR檢測(cè)方法耗時(shí)更短、結(jié)果準(zhǔn)確，但是儀器設(shè)備昂貴、對(duì)環(huán)境條件要求較高。傳統(tǒng)分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法都各有特點(diǎn)，各有弊端，在基層的診斷過(guò)程中我們常常將傳統(tǒng)分離鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)方法相結(jié)合，以更快地進(jìn)行診斷。

發(fā)生疾病后，準(zhǔn)確快速的診斷，選擇敏感的藥物是關(guān)鍵。合理用藥，選擇多種藥物交替使用，能夠降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的幾率。引起仔豬腹瀉的病因不光是病原微生物方面的，更重要的飼養(yǎng)管理方面的因素，如環(huán)境衛(wèi)生差、豬舍通風(fēng)換氣效果差、飼喂發(fā)霉變質(zhì)飼料等原因引起的仔豬免疫力下降，都會(huì)誘發(fā)仔豬發(fā)生腹瀉。貴州地區(qū)環(huán)境濕度大、晝夜溫差大、一年四季多雨，很容易造成飼料發(fā)生霉變，因此要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好環(huán)境清潔、豬舍保溫和環(huán)境消毒，減少豬群應(yīng)激。