一種直接用于碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌引起尿路感染的主動篩查研究

劉景武 王亞倩 王超 種克 張蕊

【摘 要】目的：建立一種簡便的可直接用于臨床尿液標本中，由碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌引起尿路感染的主動篩查方法，并對耐藥基因進行分型。方法：使用建立的方法對人工模擬的樣本進行檢測，確定其檢測靈敏度。對臨床樣本采用培養(yǎng)結合PCR的方法和免疫層析方法分別進行檢測，以培養(yǎng)結合PCR的方法作為金標準，評價免疫層析方法作為直接檢測臨床尿液標本中碳青霉烯耐藥腸桿菌耐藥基因快速分型的性能。結果：采用免疫層析方法檢測人工模擬樣本中的KPC酶和NDM酶，其中攜帶KPC酶的肺炎克雷伯氏菌檢測靈敏度為1×104CFU/ml， 攜帶NDM酶的大腸埃希氏菌檢測靈敏度為1×104CFU/ml。檢測了100份臨床尿液標本，與培養(yǎng)結合PCR方法相比較，采用免疫層析法直接檢測臨床尿液標本靈敏度為100%，特異性為100%，陽性預測值為100%，陰性預測值為100%，Youden，s指數(shù)為1。結論：采用離心結合免疫層析方法，可直接用于尿標本中碳青霉烯耐藥基因的篩查和基因類型。

【關鍵詞】碳青霉烯酶，分型，PCR，免疫層析

A simple and convenient method for active screening of urinary tract infection caused by carbapenem-resistant enterobacteriaceae bacteria

Liu Jingwu1， Wang Yaqian1， Wang Chao2， Zhong Ke3， Zhang rui1 1.Department of clinical laboratory， the third hospital of shijiazhuang， Hebei Shijiazhuang 050001， China；2. Department of Laboratory Medicine， Shijiazhuang People’s Hospital， Hebei Shijiazhuang 050001， China；3.Shijiazhuang Vocational College of Technology Information ， Hebei Shijiazhuang 050001， China

【Abstract】Objective：To establish a simple and direct screening method for urinary tract infection caused by carbapenemse-resistant enterobacteriaceae in clinical urine specimens， and to type the drug-resistant genes. Methods：The established method was used to detect the artificial simulated samples and determine their detection sensitivity. The culture-bound PCR method and the immunochromatography method were used to detect the clinical samples respectively.The culture-bound PCR method was used as the gold standard.The analysis software was used to analyze the detection results of the immunochromatography and evaluate its performance as a direct method to detect the rapid typing of carbapenemse-resistant enterobacteriaceae. Results：KPC enzyme and NDM enzyme in artificial simulated samples were detected by immunochromatography. Klebsiella pneumoniae carrying KPC enzyme was detected at a sensitivity of 1×104CFU/ mL， and Escherichia coli carrying NDM enzyme was detected at a sensitivity of 1×104CFU/ mL. 100 clinical urine specimens were tested， compared with the culture combined with PCR method，the sensitivity and specificity of immunochromatography were 100%， positive predictive value was 100%， negative predictive value was 100%， and Youden， S index was 1.Conclusion： The centrifugation combined with immunochromatography can be directly used to screen clinical urine samples for the presence of enterobacteriaceae bacteria carrying carbapenem resistance genes as well as the types of drug-resistant genes.

【Key？Words】Carbapenemase； Typing；PCR； Immunochromatography

由耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE）造成的感染呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前的檢測方法，不能很好地滿足臨床快速篩查的需求。免疫層析方法具有操作簡便，檢測速度快等特點，本研究采用免疫層析方法產品通過建立一套簡單的前處理方法直接用于臨床尿液標本中碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌耐藥基因判斷，并評價其應用價值[1-2]。

1.1 菌株來源

菌株分離自我院住院病人標本。

1.2 儀器及試劑

DL-96全自動細菌測定儀、上海宏石熒光定量擴增儀、 NG-Test CARBA5碳青霉烯酶檢測試劑盒。

2.1 人工模擬樣本的檢測。

2.1.1 將攜帶碳青霉烯酶的肺炎克雷伯氏菌接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h～24h，取10ml培養(yǎng)液，3500×g離心10min，菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮定量到10ml。取1ml菌懸液加入9ml無菌生理鹽水中進行10倍連續(xù)稀釋，取0.1ml稀釋液采用混菌法進行培養(yǎng)計數(shù)。其余菌懸液4℃冰箱冷藏。

2.1.2 取經計數(shù)的菌懸液定量稀釋至菌液終濃度為1×103CFU/ml～1×107CFU/ml。

2.1.3 免疫層析法檢測碳青霉烯酶：（1）取人工污染的標本10ml，3500×g離心力，離心10 min，棄去上清液，沉淀物中滴加250μl的提取緩沖液，在漩渦振蕩器上震蕩混勻數(shù)秒，靜置待用。（2）測試：使用一次性吸管吸取5滴約100μl制備好的液體加到檢測卡的樣本區(qū)，15分鐘后讀取結果。

2.2 實際樣本的檢測

選取2018年6月至2018年12月之間住院和門診患者標本。其中住院患者尿液標本80例，門診患者尿液標本20例，男性50例，女性50例，年齡40歲～80歲，平均年齡（45.35±12.39）歲如果未分離到碳青霉烯耐藥的腸桿菌科細菌繼續(xù)增大樣本量到150例。囑咐患者留取2份清潔中段尿標本于無菌容器中，每份10 ml，一份用于免疫層析法直接檢測碳青霉烯酶，一份用于培養(yǎng)。

2.2.1 免疫層析法檢測碳青霉烯酶，按照2.1.3操作步驟進行檢測。

2.2.2 碳青霉烯酶基因擴增及測序，取一份標本按照尿液標本微生物培養(yǎng)程序進行培養(yǎng)，陽性標本進行微生物鑒定和藥敏試驗。藥敏試驗結果為碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌，采用PCR方法進行碳青霉烯酶基因擴增和分型。實驗所得產物進行測序，測序結果與已知序列比對，最終確定菌株基因型。

2.3 統(tǒng)計學分析

以PCR方法作為判斷碳青霉烯耐藥腸桿菌產酶基因的金標準，對免疫層析方法進行性能評價。

3.1 免疫層析

采用免疫層析方法檢測人工模擬樣本中的KPC酶和NDM酶，其中攜帶KPC酶的肺炎克雷伯氏菌檢測靈敏度為1×104CFU/ml， 攜帶NDM酶的大腸埃希氏菌檢測靈敏度為1×104CFU/m。

3.2 實際樣本的檢測 共檢測了100份臨床尿液標本，見表1。

3.3 統(tǒng)計學分析

以培養(yǎng)結合PCR方法作為碳青霉烯耐藥基因的檢測金標準，評價免疫層析法直接檢測碳青霉烯耐藥基因的能力，結果如下：采用免疫層析法直接檢測臨床尿液標本靈敏度為100%，特異性為100%，陽性預測值為100%，陰性預測值為100%，Youden，s指數(shù)為1。

研究表明主動篩查 CRE 并施行嚴格的干預措施可以取得顯著的成效，目前，常用的碳青霉烯酶檢測、分型方法主要有表型檢測法和分子檢測技術，如Carba NP 試驗、PCR方法等，都不能很好地滿足臨床快速篩查的需求。本研究采用免疫層析試劑NG-TestCARBA5，作為篩查方法，結合離心的前處理方法，能夠直接用于碳青霉烯耐藥基因的檢測和分型，操作簡便，檢測時間短，1小時內就能完成檢測[3-4]。本研究對臨床100份尿液標本進行了檢測，受標本所限，檢測到的攜帶有碳青霉烯藥物耐藥基因的樣本數(shù)較少，檢測到的耐藥基因主要集中在KPC和NDM兩種耐藥基因上，缺少其他耐藥基因的菌株，分析其原因，可能與本地區(qū)的流行株有關，在今后的工作中繼續(xù)收集菌株，完善其他耐藥基因檢測數(shù)據(jù)。

參考文獻

[1] ZERR D M，WEISSMAN S J，ZHOU C，et al.The Molecular and Clinical Epidemiology of Extended-Spectrum Cephalosporin- and Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae at 4 US Pediatric Hospitals[J]. Journal of the Pediatric Infectious Diseases Society，2017，6（4）：366-375.

[2] ASAI N，SAKANASHI D，SUEMASTU H，et al.The epidemiology and risk factor of carbapenemresistant enterobacteriaceae colonization and infections： Case control study in a single institute in Japan[J].Journal of infection and chemotherapy：official journal of the Japan Society of Chemotherapy，2018，24（7）：505-509.

[3] 俞鳳，胡龍華，蔣沁炆.耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌的耐藥基因檢測及傳播機制探討[J].山東醫(yī)藥，2018，58（47）：36-39.

[4] 蘇曉曼，張義，李慧玲.碳青霉烯酶在主動篩查CRKP 耐藥機制中的作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2019，42（3）：52-53.

基金項目：2017年石家莊市科技局科技支撐計劃項目《耐碳青霉烯類藥物腸桿菌科細菌耐藥機制及毒力研究》（171461543）。