負(fù)載山奈酚的小麥醇溶蛋白納米顆粒的制備及其抗氧化活性研究

(劉亞男 郝柏妹 許為東 楊 麗 周 偉

(合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，合肥 230009)

近年來(lái)，從植物中提取的不同活性成分被用作創(chuàng)新的藥物載體?；诘鞍踪|(zhì)的納米載體作為藥物載體已經(jīng)受到較多關(guān)注，納米技術(shù)研究的發(fā)展在藥物輸送等制藥科學(xué)領(lǐng)域上具有良好的應(yīng)用前景。與合成蛋白相比，蛋白質(zhì)作為天然材料具有較好的生物相容性和生物降解性等優(yōu)勢(shì)[1]，因此其在材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

山奈酚(KAE)是一種天然黃酮類(lèi)藥物，存在于葡萄、洋蔥和柑橘類(lèi)水果中[2]。具有廣泛的抗炎[3]、抗癌[4]、抗氧化[5]等優(yōu)勢(shì)，但是因其水溶性差，所以難以實(shí)現(xiàn)臨床上的應(yīng)用。研究表明，黃酮類(lèi)化合物有限的水溶性和溶解度會(huì)影響其化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度[6]。而納米載體可以幫助改善KAE的溶解性和生物利用度[7]，聚合物納米顆粒具有許多優(yōu)點(diǎn)，其中就包括提高生物利用度和有效輸送疏水性化合物[8]。

麥醇溶蛋白是一種天然蛋白質(zhì)，占小麥總蛋白的40%～50%，其通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵連接的單鏈多肽組成，每條多肽鏈的平均分子量為25～100 ku[9]。然而，由于小麥醇溶蛋白納米顆粒之間相對(duì)較強(qiáng)的疏水性而使其在有些溶液中趨于聚集。為了使其穩(wěn)定，必須仔細(xì)控制溶液的pH值和離子強(qiáng)度，以產(chǎn)生強(qiáng)靜電排斥力[10]。已有研究表明，可以通過(guò)在小麥醇溶蛋白納米顆粒上覆蓋帶電荷的生物聚合物，例如殼聚糖[11]、卵磷脂[12]、果膠[13]。因此，本研究通過(guò)反溶劑法制備山奈酚-小麥醇溶蛋白納米顆粒(KAE-GNPs)，考察其納米粒子的穩(wěn)定性、生物相容性和抗氧化活性，為解決難溶性藥物的應(yīng)用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

谷朊粉；山奈酚，純度≥98%；透析袋(截流量14 000 ku)；新鮮兔血；DPPH,純度為96%；DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；青霉素、鏈霉素雙抗；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、甘露醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano ZS90納米粒度儀，Zeta電位儀，SU8000場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，Nicolet iS5傅里葉紅外光譜儀，HERAcell 150i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，IX71倒置相差顯微鏡，ELx800酶標(biāo)儀。

1.3 山奈酚-小麥醇溶蛋白納米顆粒制備

1.3.1 小麥醇溶蛋白提純

取一定量的谷朊粉，加入10倍量的二氯甲烷，攪拌1 h脫脂處理。脫脂后的谷朊粉加入10倍量的70 %乙醇，攪拌4 h后以10 000 r/min的速度離心10 min取上清液，旋蒸去除乙醇。將體系液置于透析袋中，投入蒸餾水中透析去除剩下的乙醇，再投入至0.05 mol/L稀醋酸溶液中透析24 h，除去部分酸溶性的低分子量谷蛋白，之后用去離子水透析至中性，分裝凍干備用。

1.3.2 山奈酚-小麥醇溶蛋白納米顆粒的制備

根據(jù)王昶光[14]的研究，采用反溶劑法制備KAE-GNPs。將山奈酚與小麥醇溶蛋白分別按1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的比例加入至體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中，超聲助溶。隨后將混合液緩慢滴加至pH 6的去離子水中，滴畢后繼續(xù)攪拌5 min，旋蒸去除乙醇后得到的KAE-GNPs懸液以20 000 r/min的速度離心10 min去除上清液,加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%葡萄糖和2%甘露醇作為凍干劑支架，凍干備用。在不加入山奈酚的情況下重復(fù)上述操作得到空載的小麥醇溶蛋白納米顆粒(GNPs)。

1.4 材料表征

1.4.1 納米粒子的粒徑、電位及PDI的測(cè)定

取1.5 mL納米粒子分散液放入樣品池中，使用馬爾文粒徑儀測(cè)定其粒徑、電位及PDI。

1.4.2 KAE-GNPs的包埋率及載藥率

配制不同濃度的山奈酚溶液，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在370 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸收值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線(xiàn)(y=0.076 6x+0.046 6，R2=0.999)。

將KAE-GNPs懸液以20 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，使用紫外分光光度計(jì)在370 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)上清液中山奈酚的含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線(xiàn)計(jì)算出游離山奈酚質(zhì)量。

稱(chēng)取一定質(zhì)量的KAE-GNPs溶于70%乙醇中，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在370 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)溶液中山奈酚的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線(xiàn)計(jì)算出山奈酚質(zhì)量。根據(jù)公式計(jì)算包埋率與載藥率：

1.4.3 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

將2.0 mg凍干樣品放置于紅外光譜儀指定位置直接掃描，光譜采集范圍為500～4 000 cm-1，分辨率設(shè)置為4 cm-1。

1.4.4 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)分析

將冷凍干燥后的樣品均勻地粘在導(dǎo)電膠上，在其表面濺射涂覆一層金層，然后在5.0 kV加速電壓下用FE-SEM觀(guān)察樣品。

1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取凍干后的KAE-GNPs分散于去離子水中，配制為1 mg/mL的分散液，置于常溫下保存，定期檢測(cè)粒徑變化。

1.6 血液相容性實(shí)驗(yàn)

按照梯度濃度(200、400、600、800、1 000 μg/mL)將KAE-GNPs與新鮮兔血孵育4 h后，使用紫外分光光度計(jì)在541 nm處測(cè)其吸收值。

1.7 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

將KAE-GNPs(100、300、500 μg/mL)和KAE(5.4、16.2、27 μg/mL)溶液按濃度梯度與DPPH溶液混合，靜置30 min后測(cè)定其在519 nm處吸收值，記A1。陰性對(duì)照組記A0。根據(jù)公式計(jì)算自由基清除率：

1.8 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.8.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)于5% CO2，37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.8.2 MTT測(cè)試

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中HUVEC,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。其中，空白組組加入100 μL培養(yǎng)基，處理組每孔加入100 μL 的KAE-GNPs(100、300、500 μg/mL)和KAE溶液(5.4、16.2、27 μg/mL)，孵育24 h后每孔加入10 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h，去除培養(yǎng)基后，每孔加入150 μL DMSO，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.8.3 清除細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中HUVEC，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，放置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h至細(xì)胞貼壁。將GNPs(500 μg/mL)、KAE(27 μg/mL)、KAE-GNPs(500 μg/mL)與H2O2共同孵育細(xì)胞1 h后，用PBS洗滌3次。加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針?lè)跤?0 min，用PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下成像。使用ImageJ對(duì)熒光圖進(jìn)行熒光定量分析，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度：

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，應(yīng)用Origin和Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用單因素方差分析比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同投藥比對(duì)納米粒子的影響

如圖1所示，KAE-GNPs的平均粒徑隨投藥比的增大而增大。納米粒子的粒徑控制著其在體內(nèi)的分布，不同投藥比的平均粒徑在272～399 nm之間。當(dāng)山奈酚與麥醇溶蛋白的質(zhì)量比從1∶10減少至1∶40時(shí)，其載藥率明顯降低，而包埋率明顯增加(表1)，這說(shuō)明包埋率與載藥率和投藥比相關(guān)。當(dāng)投藥比從1∶10增大至1∶5時(shí)，納米粒子的包埋率與載藥率的變化幅度并不明顯，粒徑從291 nm增加至399 nm，這可能是由于投藥量過(guò)大，游離的KAE以吸附的形式附著在麥醇溶蛋白表面，導(dǎo)致納米粒子的粒徑突然增加。PDI代表納米顆粒的分散指數(shù)，它的降低說(shuō)明納米粒子更加均一。因此綜合考量納米粒子的粒徑、載藥率、包埋率和電位，選擇投藥比為1∶10的比例進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同投藥比KAE-GNPs的粒徑分布

表1 山奈酚的包埋率與載藥率

2.2 納米粒子的粒徑分布及電鏡分析

在優(yōu)化條件因素后制備出的KAE-GNPs平均粒徑為150.9 nm(圖2)，PDI<0.2，說(shuō)明粒子較為均一。載藥納米粒子具有較高的電位，正電荷之間的排斥作用使得納米粒子具備較低的分散度，增加了其穩(wěn)定性。空載小麥醇溶蛋白納米顆粒的粒徑在100 nm左右(圖3a)，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的基本一致。載藥后的納米粒子的粒徑主要呈現(xiàn)球形，粒子較為均一，粒子之間并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的交聯(lián)(圖3b)，但是實(shí)際的粒徑在200 nm左右，這可能是由于粒度儀測(cè)得的數(shù)據(jù)是水合粒徑。

圖2 KAE-GNPs載藥納米顆粒的粒徑分布

圖3 GNPs及KAE-GNPs的掃描電鏡圖(500 nm)

2.3 納米粒子穩(wěn)定性分析

在麥醇溶蛋白納米顆粒表面包覆帶電荷的生物聚合物或兩親生物聚合物是目前解決其穩(wěn)定性和溶解性問(wèn)題的主要策略[16]。復(fù)溶后的KAE-GNPs粒徑明顯增加，這是由于葡萄糖和甘露醇以靜電作用的方式吸附在納米粒子的表面，增大了粒子的粒徑。在28 d的貯存過(guò)程中，粒子的水分散液并未出現(xiàn)明顯的變化，流體力學(xué)直徑也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的增加(圖4)，這說(shuō)明KAE-GNPs具有良好的穩(wěn)定性和水分散性。

圖4 KAE-GNPs在水分散液中28 d的粒徑變化

2.4 傅里葉紅外變換光譜分析

如圖5所示，小麥醇溶蛋白在3 274.54 cm-1處有一個(gè)明顯的峰，這是由于羥基的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的[17]。在加入山奈酚之后，羥基的峰從3 274.54 cm-1移至3 288.04 cm-1，這表明小麥醇溶蛋白與山奈酚之間形成了氫鍵[18]。

圖5 KAE-GNPs、山奈酚和GNPs的FTIR圖

2.5 生物相容性分析

良好的生物相容性是作為給藥載體材料的必要條件。隨著KAE-GNPs和山奈酚的濃度增加，HUVEC存活率明顯下降(圖6)。HUVEC在KAE-GNPs(500 μg/mL)和KAE(27 μg/mL)孵育24 h后存活率分別為80.1%和49.3%，差異性顯著(P<0.01)。將梯度濃度的KAE-GNPs與新鮮采集的兔血孵育4 h，所有KAE-GNPs處理組的溶血率均<2%，與陰性對(duì)照組(0.9% NaCl)相比無(wú)顯著性差異(圖7)。這說(shuō)明KAE-GNPs具有很好的生物相容性，這是因?yàn)樾←湸既艿鞍讓?duì)細(xì)胞具有促增殖作用[14]。綜上所述，KAE-GNPs具有較低的細(xì)胞毒性和溶血率，且復(fù)溶效果良好，因此可以以?xún)龈蓜┑男问奖４妫米髯⑸鋭?/p>

圖6 不同濃度的KAE-GNPs和KAE對(duì)對(duì)HUVEC細(xì)胞的抑制作用(**：P<0.01)

圖7 不同濃度的KAE-GNPs的溶血率

2.6 抗氧化活性以及清除細(xì)胞內(nèi)ROS分析

KAE-GNPs與KAE清除DPPH能力隨著濃度的增加而呈現(xiàn)出線(xiàn)性升高的趨勢(shì)(圖8)，二者的IC50濃度分別為281、482 μg/mL，KAE-GNPs表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除自由基能力，這是由于麥醇溶蛋白本身具有一定的抗氧化能力[22]，其次可能是由于小麥醇溶蛋白與山奈酚的相互作用在一定程度上改變了山奈酚的分子空間結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了其抗氧化的能力。

注：與KAE組相比，*為P<0.05；***為P<0.001。

如圖9所示，未加H2O2組中的熒光信號(hào)十分微弱，細(xì)胞產(chǎn)生少量的活性氧屬于正常現(xiàn)象。在H2O2處理后產(chǎn)生了強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，這說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了大量的活性氧?？梢悦黠@看到的是，HUVEC中由ROS探針被H2O2氧化而產(chǎn)生的強(qiáng)烈綠色熒光被KAE-GNPs和KAE孵育后明顯減弱，但是二者之間仍具有顯著性差異(圖10)。這證實(shí)了KAE是可以有效清除細(xì)胞內(nèi)的ROS[23]。而納米粒子可以提高細(xì)胞對(duì)藥物的攝取能力[24],這可能是KAE-GNPs能夠更有效清除細(xì)胞ROS 的原因，但是具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

圖9 活性氧染色圖(標(biāo)尺：100 μm)

注：與H2O2組相比，NS 無(wú)顯著性差異；*P<0.05 **P<0.01。與H2O2+KAE組相比，## P<0.01。

3 結(jié)論

通過(guò)反溶劑法制備出表面光滑、大小均一的KAE-GNPs，KAE主要通過(guò)氫鍵、靜電作用和疏水作用等分子間相互作用與小麥醇溶蛋白結(jié)合，KAE-GNPs具有良好的穩(wěn)定性以及生物相容性，同時(shí)表現(xiàn)出較好的清除細(xì)胞內(nèi)ROS的能力，為后續(xù)體內(nèi)抗氧化研究提供了參考。KAE-GNPs在氧化應(yīng)激和抗炎方面的應(yīng)用以及機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。