食品中米酵菌酸測定方法研究進(jìn)展

(董憲兵 趙 博 周純潔 候美玲 吳彥蕾

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121)

椰毒伯克霍爾德菌可以產(chǎn)生兩種毒素，分別是米酵菌酸(Bongkrek acid)和毒黃素(Toxoflavin)，兩者共同導(dǎo)致了中毒癥狀，米酵菌酸的毒性更強(qiáng)。米酵菌酸是一種熱穩(wěn)定的高度不飽和的三羧酸脂肪酸，具有很強(qiáng)的生物活性，是椰毒假單胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產(chǎn)物，在20世紀(jì)30年代，由荷蘭學(xué)者M(jìn)erten和Vanveen發(fā)現(xiàn)[1]。米酵菌酸基本無味，很難察覺，其耐熱性極強(qiáng)，即使用100℃的開水煮沸或用高壓鍋蒸煮也不能破壞其毒性，進(jìn)食后即可引起中毒。多種食物如自制谷類發(fā)酵食品、銀耳和木耳等易受椰毒假單胞菌污染而產(chǎn)生米酵菌酸毒素，食用含有該毒素污染的食物會引起人或動物中毒，目前對米酵菌酸尚無特效解毒藥物，一旦中毒，病死率在40%～100%。近年來，我國發(fā)生過多起因食用含有米酵菌酸的食品導(dǎo)致中毒死亡的事件。如2012年山東省臨沂市，2014年云南文山州，2018年廣東省東莞市，2020黑龍江均發(fā)生食用被米酵菌酸污染的食品導(dǎo)致的中毒死亡事件[2-5]。因此，對食品中米酵菌酸的檢測是不可或缺的。目前，對食品中米酵菌酸的檢測方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以及近年來發(fā)展起來的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法、超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法等。

1 食品中米酵菌酸檢測方法

1.1 薄層色譜法

薄層色譜法是將吸附劑或支持劑在玻璃或塑料板涂一薄層，將待分析樣品滴加到薄層上，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┱归_而達(dá)到分離，鑒定和定量分析的目的，具有樣品需求量少，設(shè)備要求簡單和檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)[6]。薄層色譜法多用于食品中生物活性的測定、蜂蜜的鑒別、生物堿成分分析等領(lǐng)域[7-9]。早期國內(nèi)外學(xué)者把薄層色譜法應(yīng)用到米酵菌酸的測定，胡文娟等[10]對酵米面和銀耳中的米酵菌酸的提取和薄層分離條件進(jìn)行了研究，建立了測定酵米面和銀耳中的米酵菌酸的薄層色譜法。HU等[11]用交聯(lián)葡聚糖LH-20凝膠過濾和C-18反相柱層析法從玉米粉中分離出米酵菌酸，并用薄層色譜法進(jìn)行識別和分析。薄層色譜法對食品中米酵菌酸測定的應(yīng)用較早，但是因其步驟復(fù)雜，靈敏度低，不適合大批量樣品的檢測而逐漸被其他檢測方法替代。

1.2 分光光度法

分光光度法測定食品中的米酵菌酸，以其操作簡單，儀器價格低廉為主要特點(diǎn)，是實驗室分析使用的分析方法。2018年馬忠賓等[12]建立了紫外分光光度法測定食品中的米酵菌酸，并申請了相關(guān)專利，該方法用氨水甲醇溶液作為提取溶劑，處理粉碎后的樣品加入溶劑經(jīng)震蕩、超聲、提取、分液加入碳酸氫鈉溶液分離，加入石油醚分離后濃縮，最后用甲醇溶解后在紫外分光光度計上比色進(jìn)行測定。閻立榮[13]應(yīng)用線性組合導(dǎo)數(shù)的統(tǒng)計學(xué)方法建立了能同時測定米酵菌酸和毒黃素的分光光度法，此方法克服了各種組分波長嚴(yán)重重疊時難以測定的困難，具有選擇性強(qiáng)，精密度好的優(yōu)點(diǎn)。黃建立[14]用紫外分光光度法測定變質(zhì)銀耳中米酵菌酸含量，并與高效液相色譜法的測定結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果表明測定結(jié)果無顯著差異。但是分光光度法在測定食品米酵菌酸中存在專屬性差，靈敏度低的缺點(diǎn)。

1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法測定食品中的米酵菌酸應(yīng)用研究非常廣泛，GB 5009.189—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測定》中也是用高效液相色譜法測定米酵菌酸，但國標(biāo)測定范圍適用于銀耳及其制品、酵米面及其制品，其他食品類別中的米酵菌酸的測定還沒有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，而且該標(biāo)準(zhǔn)方法前處理過程繁瑣、有機(jī)試劑消耗量大，難以實現(xiàn)樣品批量處理。俞穗珍[15]在參照標(biāo)準(zhǔn)的方法基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化的固相萃取方法，提取工藝，進(jìn)樣量的大小，選擇流動相pH 值大小，探索出更加快速、便捷、準(zhǔn)確的方法來測定新鮮銀耳中的米酵菌酸，縮短了樣品前處理周期，減少了有機(jī)試劑的消耗量，節(jié)約了成本。侯佰立[16]應(yīng)用固相萃取技術(shù)并結(jié)合高效液相色譜儀建立了固相萃取-高效液相色譜測定食品中米酵菌酸殘留的方法，該方法用甲醇和氨水作為提取溶劑，經(jīng)混合型強(qiáng)陰離子固相萃取柱凈化，濃縮過濾后用高效液相色譜儀在267 nm紫外波長處進(jìn)行分析。結(jié)果表明米酵菌酸測定結(jié)果在一定線性范圍內(nèi)線性良好，R2為0.999 7，回收率高。李紅艷等[17]通過考察樣品的不同提取條件和不同固相萃取柱的凈化效果，建立了混合型弱陰離子固相萃取富集凈化，高效液相色譜-二極管陣列檢測器快速測定食品中米酵菌酸殘留的方法。該方法以80%乙腈水為提起溶劑，經(jīng)WAX固相萃取小柱凈化，以269 nm為分析波長進(jìn)行分析，米酵菌酸在0.1～40 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r值大于0.999。石聲鑫[18]比較了不同提取溶劑和不同萃取工藝對食品中米酵菌酸提取效率的影響，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定食品中米酵菌酸殘留的方法。蘇永恒[19]優(yōu)化了液相色譜的色譜條件、提取和凈化條件，建立了固相萃取-高效液相色譜方法測定食品中米酵菌酸含量，可滿足食品中米酵菌酸含量的檢測要求。周霞[20]采用C18色譜柱，以甲醇和1%乙酸為流動相，檢測波長為267 nm，建立混合型強(qiáng)陰離子(MAX)全自動固相萃取富集凈化，超高效液相色譜法快速檢測食品中米酵菌酸殘留量。但高效液相色譜法分析時間較長，易受樣品基質(zhì)干擾致使定性定量出現(xiàn)偏差，對低濃度樣品定性能力不夠，樣品取樣量較大。

1.4 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

隨著檢測行業(yè)的飛速發(fā)展，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的應(yīng)用越來越普及。相對液相色譜法，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)前處理更加簡單，分析時間短，專屬性好，靈敏度高，適合大批量樣品的快速檢測。蘇肯明[21]采用甲醇：0.02 M乙酸銨緩沖溶液(85∶15)為流動相，用電噴霧負(fù)離子源(ESI-)進(jìn)行離子化，多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)對米酵菌酸的母離子及子離子進(jìn)行監(jiān)測，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定銀耳中的米酵菌酸的新方法。周鵬[22]把粉碎后的銀耳樣品用甲醇提取，混合強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱(PAX)凈化，UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)色譜柱分析，以10 mmol/L乙酸銨-乙腈為流動相，梯度洗脫，串聯(lián)四級桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測負(fù)離子模式檢測，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，建立了快速測定銀耳中米酵菌酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。曾令浩[23]建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測銀耳中的米酵菌酸的方法。銀耳樣品用甲醇提取后，超聲振蕩，離心分層，上清液用甲醇定容。使用空白基質(zhì)液配置標(biāo)準(zhǔn)曲線對結(jié)果進(jìn)行校正，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下，采用負(fù)離子模式進(jìn)行電離，并通過多反應(yīng)監(jiān)測模式對目標(biāo)化合物的定量離子和定性離子進(jìn)行測定。覃冬杰[24]建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定柳州螺螄粉中米酵菌酸的分析方法，該方法通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜方法(色譜柱、流動相、質(zhì)譜條件)、提取條件(提取溶劑的選擇)、凈化條件的選擇，并設(shè)計正交試驗得到最佳的螺螄粉中的米酵菌酸的測定方法。曾雪芳[25]研究了不同基質(zhì)米粉和河粉中的米酵菌酸的測定方法，試樣經(jīng)提取，凈化，濃縮及過濾后，以0.1%甲酸水和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源負(fù)模式檢測，外標(biāo)法定量?；诿捉途嵘V和質(zhì)譜行為的研究，對其儀器測定條件進(jìn)行優(yōu)化，并對優(yōu)化后的方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，結(jié)果表明該方法靈敏度高，專屬性好，準(zhǔn)確可靠，適用于米粉和河粉基質(zhì)中米酵菌酸的測定。李紅娜等[26]建立了用液相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用測定配方米粉中米酵菌酸的方法，該方法快速簡單。用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定米酵菌酸不僅在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在中藥和刑偵檢驗領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用[27-29]。

1.5 超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜

隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)的廣發(fā)應(yīng)用，相對于常規(guī)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法使用多反應(yīng)監(jiān)測模式通過目標(biāo)物的離子對進(jìn)行定量分析，超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-OrbitrapHRMS)具有分辨率高及定量能力好的優(yōu)點(diǎn)，利用目標(biāo)物母離子的精確分子量直接定量，無需對目標(biāo)物逐個優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù)，對于多目標(biāo)物分析可以極大地降低檢測方法的時間，同時又能很好地避免低分辨質(zhì)譜易受基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性的現(xiàn)象[30，31]。針對目前測定米酵菌酸的前處理過程均需要使用混合型陰離子固相萃取柱進(jìn)行凈化，耗時長、溶劑消耗大的問題，梁明[32]建立了QuEChERS+EMR-Lipid結(jié)合超高效液相色譜-四極桿_靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速測定河粉中的米酵菌酸的方法，該方法采用 QuEChERSEMR-Lipid技術(shù)對樣品進(jìn)行凈化，可以大大縮短前處理時間。并且選用高分辨質(zhì)譜對處理后的樣品進(jìn)行測定，提高方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。此方法大大縮短前處理時間，提高食品中米酵菌酸的檢測分析效率。 Liang等[33]應(yīng)用納米管技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜建立了米粉中米酵菌酸的測定方法，并設(shè)計了響應(yīng)面對前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明該方法適用于米粉中米酵菌酸的測定，回收率為79.8%～102.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.2%～7.1%。超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法簡化了分析步驟，提高了分析效率和檢測準(zhǔn)確性，但是該方法配套儀器購買成本較高，儀器后期維護(hù)保養(yǎng)成本較高，使該方法的推廣普及受到一定的限制。

2 結(jié)論與展望

近年來食品中米酵菌酸污染而引發(fā)的中毒事件時有發(fā)生，目前國內(nèi)對米酵菌酸污染的監(jiān)管還處于比較薄弱的環(huán)節(jié)，許多學(xué)者對米酵菌酸的測定方法進(jìn)行了大量研究，并且不斷的改進(jìn)。隨著監(jiān)管部門對米酵菌酸污染問題的重視，米酵菌酸污染將會納入監(jiān)管范疇，但是目前只有GB 5009.189—2016這一項食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液相色譜法對米酵菌酸測定，該方法樣品需求量較大，前處理步驟復(fù)雜，溶劑消耗量大。目前，急需開發(fā)更加快速、準(zhǔn)確的檢測方法將成為該領(lǐng)域重點(diǎn)研究方向之一。隨著實際檢測需求和技術(shù)水平的不斷提高，色譜檢測技術(shù)已經(jīng)逐漸由低分辨向高分辨方向發(fā)展，以滿足建立高靈敏度、高選擇性、高分析通量、簡便快速實用分析方法的需要。