限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白功能特性、結(jié)構(gòu)的影響及其在冰淇淋中的應(yīng)用

(李泓頡 秦那日蘇 包小蘭

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

亞麻籽是內(nèi)蒙古優(yōu)勢(shì)特色資源，年產(chǎn)亞麻籽約40萬t[1]。亞麻籽目前主要用于壓榨制油，而榨油后的亞麻籽餅主要用于加工飼料，其實(shí)亞麻籽餅中含有豐富的蛋白質(zhì)，為20%～40%，亞麻籽蛋白必需氨基酸組成較合理，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，但目前內(nèi)蒙地區(qū)對(duì)其深加工利用不充分，造成植物蛋白資源浪費(fèi)[2]，因此對(duì)其深加工利用刻不容緩。

近些年來亞麻籽蛋白的加工利用受到了國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，但目前關(guān)于亞麻籽蛋白的研究主要集中于提取工藝的探討，對(duì)亞麻籽蛋白的功能特性、應(yīng)用、改性等方面的研究不夠深入。在亞麻籽蛋白功能特性方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者僅對(duì)其熱變性、乳化能力、起泡性、持水性及溶解性做了初步研究。而在應(yīng)用方面，也僅用于飲料、能量棒、面包以及火腿腸等產(chǎn)品中[3]。關(guān)于亞麻籽蛋白的改性方面的研究鮮有報(bào)道。另外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)堿溶酸沉法提取的亞麻籽蛋白具有溶解性、起泡性等功能特性較差的問題，因此，需要適宜的方法來改善亞麻籽蛋白的功能特性，使其更好地應(yīng)用于食品加工中[4]。

目前我國(guó)植物蛋白主要利用方式可分為加工飼料、直接食用、食品添加劑與配料加工等。其中作為食品配料與添加劑是我國(guó)植物蛋白資源利用的新途徑[5]。植物蛋白質(zhì)會(huì)對(duì)食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和加工性狀產(chǎn)生重大影響，這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)具有溶解性、起泡性、乳化性等功能特性[6-8]。不同種食品對(duì)配料植物蛋白有其特有的功能特性要求，任何一種蛋白都很難同時(shí)兼具多種功能特性，而這恰恰是生產(chǎn)上所需要的，如何將蛋白質(zhì)應(yīng)用于各種不同類型的食品體系，其核心就是蛋白質(zhì)的改性技術(shù)?，F(xiàn)在常用的蛋白質(zhì)改性方法有：超聲改性、酶解改性、高壓改性、熱改性、糖基化改性[9]。其中限制性酶解改性是常用方法，其優(yōu)點(diǎn)主要有：作用專一性強(qiáng)、效率高、反應(yīng)條件溫和、毒副作用小等[10]。近些年來，一些研究證實(shí)限制性酶解對(duì)植物源蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性等均有改善的作用。例如，葵花籽分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶限制性酶解后溶解性、乳化性、起泡性均顯著提高[11]。藍(lán)圓鲹分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶限制性酶解后較原蛋白的溶解性、乳化性、起泡性及持油性也顯著提高[12]。大豆?jié)饪s蛋白經(jīng)中性蛋白酶限制性酶解后較原蛋白的乳化性、持油性也顯著提高[13]。還有研究表明蛋白質(zhì)經(jīng)水解后的功能特性取決于其水解時(shí)間長(zhǎng)短即水解度大小，當(dāng)水解度過大時(shí)導(dǎo)致水解物即多肽分子質(zhì)量過低無法吸附在油水界面，削弱其乳化性等功能特性，因此通過水解改善蛋白分子功能特性其水解度應(yīng)控制在較低范圍，即需進(jìn)行限制性酶解[14]。但目前限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響尚不清楚。假設(shè)限制性酶解會(huì)改變亞麻籽分子結(jié)構(gòu)和功能特性，這將擴(kuò)大亞麻籽蛋白在食品中的應(yīng)用范圍。

冰淇淋是一種深受消費(fèi)者喜愛的休閑食品。然而當(dāng)今食品市場(chǎng)傾向于“健康飲食”，高糖、高油類型的冰淇淋由于含熱量過高，大量攝入不利于消費(fèi)者的健康。因此如何將天然功能性食物成分如優(yōu)質(zhì)的植物蛋白等應(yīng)用于冰淇淋中生產(chǎn)低糖、低油的冰淇淋產(chǎn)品引起了廣泛關(guān)注。韓雅君[15]制作出了添加富含11組分大豆蛋白質(zhì)的冰淇淋，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出較高的膨脹率、良好質(zhì)地及風(fēng)味，可以顯著改善冰淇淋品質(zhì)。亞麻籽蛋白也是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，其是否同大豆蛋白一樣適合添加在冰淇淋中值得探討。

本研究以低溫脫脂亞麻籽餅為原料，利用堿溶酸沉法制備亞麻籽蛋白，并對(duì)其進(jìn)行限制性酶解，分析對(duì)其功能特性及結(jié)構(gòu)的影響，探討酶解亞麻籽蛋白結(jié)構(gòu)變化與功能特性之間的關(guān)系及其在冰淇淋中的應(yīng)用，為指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐中獲得所期望的功能特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要材料與試劑

低溫壓榨亞麻籽餅(粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%)；堿性蛋白酶(Alcalase，10 000 U/g)；甘氨酸、Tris、5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS):分析純；脫脂奶粉、白砂糖、單甘酯、瓜爾豆膠、草原黃油、純牛奶。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2300紫外分光光度計(jì)，IKA-T10均質(zhì)機(jī)，K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀，F(xiàn)DU-2200真空濃縮冷凍干燥機(jī)，J-815圓二色光譜儀，Nanolog FL3-2iHR熒光光譜儀，LB-550動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀，S-3000N掃描電子顯微鏡，CKX41倒置熒光顯微鏡，XHF-DY高速分散器，家用小型自動(dòng)冰淇淋機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 亞麻籽蛋白的制備

參照鄭睿[16]的方法制備亞麻籽蛋白。將低溫壓榨亞麻籽餅粉碎、進(jìn)一步脫脂處理。稱取20 g脫脂亞麻籽餅粉，按料液比1∶35加入去離子水，用10%NaOH調(diào)節(jié)脫脂亞麻籽粉溶液的pH至8.5，50 ℃下恒溫提取2 h，4 000 r/min離心15 min去除沉淀物，調(diào)節(jié)pH至4.4，靜置30 min后離心去除上清液，使用1∶5去離子水洗滌沉淀2次，調(diào)節(jié)pH至7.0，冷凍干燥得亞麻籽蛋白，-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 限制性酶解亞麻籽蛋白的制備

稱取亞麻籽蛋白10 g于燒杯中，按料液比1∶20加入去離子水200 mL，常溫下攪拌均勻后用10% NaOH調(diào)節(jié)亞麻籽蛋白粉溶液的pH至8.0，加熱至50 ℃于恒溫水浴鍋中，按E/S=1%的比例加入100 μL堿性蛋白酶于亞麻籽蛋白溶液中，酶解10 min后用液氮速凍，存放在-86 ℃的冰箱，再經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.2.3 亞麻籽蛋白水解度的測(cè)定

稱取2 g的亞麻籽蛋白于燒杯中，加入100 mL的蒸餾水后調(diào)節(jié)的pH至8.0，加熱至50 ℃于恒溫水浴鍋中，加入20 μL堿性蛋白酶于亞麻籽蛋白溶液中，混合均勻后，使用濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液來保持酶解反應(yīng)體系的pH始終為8.0，并在酶解時(shí)間為0、5、10、15、20 min時(shí)記錄NaOH消耗量，并進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。通過公式計(jì)算水解度：

式中：h為蛋白質(zhì)被水解的肽鍵的量/mmol/g；htot為蛋白質(zhì)肽鍵的總量/mmol/g；B為酶解過程中堿液消耗體積/mL；Nb為表示堿液濃度/mol/L；Mp為表示水解液中蛋白質(zhì)量/g；1/α為校正系數(shù)/g。

1.2.4 亞麻籽蛋白溶解性的測(cè)定

參照Le等[17]和Yang等[18]的方法稍作改動(dòng)，稱取0.2 g樣品加入20 mL、 pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，將溶液在30 ℃水浴鍋中以120 r/min的速度，連續(xù)攪拌60 min，4 000 r/min離心15 min，采用凱式定氮法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。通過公式計(jì)算：

1.2.5 起泡性(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)的測(cè)定

參照Yin等[19]的方法并做一定調(diào)整，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制濃度為1%的蛋白質(zhì)樣品溶液。取50 mL置于高速組織攪拌機(jī)內(nèi)，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪打2 min。記錄泡沫體積，靜置30 min后，再次記錄泡沫體積。起泡性(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)通過公式計(jì)算：

式中：V0為攪打剛停止時(shí)泡沫體積/mL；VL為樣品溶液體積/mL；V30為靜置30 min后的泡沫體積/mL。

1.2.6 乳化性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)的測(cè)定

參照Liu等[20]的方法，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制濃度為1%的蛋白質(zhì)樣品溶液。將蛋白質(zhì)溶液與大豆油混合(3∶1)，在12 000 r/min的條件下均質(zhì)2 min。分別在0 min和靜置10 min時(shí)從容器中取50 μL乳濁液，加入到裝有5 mL1 g/L的SDS溶液的試管中，以SDS為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度值。

式中:A0為零時(shí)刻的吸光度值；Φ為溶液中油的體積分?jǐn)?shù)，0.25；C為原樣品的溶液質(zhì)量濃度/g/mL；ESI為乳化穩(wěn)定性；A10為乳液靜置10 min后的吸光度值。

1.2.7 持油性、持水性的測(cè)定

參照何興芬[21]的方法，稱取0.5g亞麻籽蛋白于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水/油，在25 ℃下，用磁力攪拌器攪拌5 min，形成均勻的懸濁液，5 000 r/min離心30 min，除去上層水分/油份，稱量樣品和離心管的總質(zhì)量。

式中：m0為蛋白樣品質(zhì)量/g；m1為樣品和離心管的總質(zhì)量/g；m2為沉淀和離心管的總質(zhì)量/g。

1.2.8 圓二色譜(CD)測(cè)定

稱取5 mg的蛋白樣品，溶于5 mL磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)中，在室溫下攪拌30 min，于25 ℃離心(10 000 r/min，10 min)，上清液稀釋至0.1 mg/mL，在室溫和連續(xù)充氮的條件下測(cè)其圓二色譜。光譜分析條件：遠(yuǎn)紫外區(qū)域(190～250 nm)，速度為50 nm/min，光譜間隔0.1 nm，實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃，樣品池光程為2 mm，4次累計(jì)掃描的均值。采用曲線擬合軟件CDPro計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。

1.2.9 粒度的測(cè)定

將動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀進(jìn)行預(yù)熱30 min，打開粒度分析系統(tǒng)，開啟攪拌器和超聲波開關(guān)，攪拌器順循環(huán)，清洗粒徑儀至遮光率為0.00%，將樣品緩慢加到樣品槽中，直至軟件顯示濃度正常，遮光率至5%以上，待遮光率波動(dòng)極小后采取數(shù)據(jù)。

1.3.0 表面巰基含量的測(cè)定

A液：Tris-Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.004 mol/L EDTA，pH為8.0)；B液：Ellman′s試劑(4 mg/mL DTNB)。取蛋白樣品60 mg溶于10 mL A液中添加80 μL B液，在25 ℃保溫1 h后，于25 ℃離心(10 000 r/min,10 min)，取上清液在λ=412 nm下測(cè)吸光度值(A),沒有蛋白質(zhì)的緩沖溶液用作試劑空白。表面巰基含量計(jì)算公式為：

式中：A412為除去試劑空白后樣品的吸光度值；D為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)含量。

1.3.1 表面疏水性的測(cè)定

參照Haskard等[22]的方法。將不同條件下的樣品溶液用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L)稀釋為不同濃度(0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mg/mL)。然后將20 μL的1-苯胺基萘-8-磺酸溶液(ANS)(8.0 mmol/L，pH 7.0)分別加入配制好的不同濃度緩沖溶液，用漩渦振蕩儀充分混合，將其放置在暗環(huán)境中反應(yīng)15 min。設(shè)置發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，在此條件下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，斜率表示蛋白表面疏水性。

1.3.2 掃描電鏡分析

用掃描電鏡觀察蛋白樣品的結(jié)構(gòu)形貌，取樣品粘貼到樣品臺(tái)上，進(jìn)行噴金鍍膜處理，放入掃描電鏡抽真空，施加一定電壓，調(diào)整束斑尺寸，聚集清晰后，拍攝樣品的形貌和結(jié)構(gòu)圖像。

1.3.3 限制性酶解亞麻籽蛋白軟質(zhì)冰淇淋的制備

1.3.3.1 工藝流程

配料混合→均質(zhì)→殺菌→冷卻→老化→凝凍→灌裝→硬化→成品

1.3.3.2 操作要點(diǎn)

原料預(yù)混：準(zhǔn)備6份相同配比的脫脂奶粉(8%)、牛奶(67.5%)、草原黃油(9%)、白砂糖(13%)、雞蛋(2.2%)、單甘酯和瓜爾豆膠(共0.3%)原料，將限制性酶解亞麻籽蛋白按2%、4%、6%、8%、10%的比例代替脫脂奶粉。分別將6份原料預(yù)先混勻，使其中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到11.85%，總固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)34.56%。均質(zhì)：將漿料于20 MPa、45 ℃條件下均質(zhì)2 min處理。殺菌：將混合均勻的漿液，加熱至85 ℃，保溫20 s。冷卻老化：將殺菌后的物料液于4 ℃冷藏老化12 h。凝凍：將老化好的物料液放入家用小型冰淇淋機(jī)中，在攪拌下凝凍，這樣空氣就以極小的氣泡均勻地分布于冷凍的料液中，使物料液的體積膨脹，形成冰淇淋。灌裝硬化：凝凍后的物料液放入塑料盒中。將凍好的冰淇淋在-80 ℃放置2 h后于-20 ℃儲(chǔ)存。

1.3.4 冰淇淋膨脹率的計(jì)算

參考Pereira等[23]的方法略作修改。通過比較質(zhì)量來測(cè)量膨脹率，分別稱取凝凍前后一定體積的混合料質(zhì)量。膨脹率計(jì)算公式為：

式中：m1為凝凍前相同體積下混合料的質(zhì)量/g；m2為凝凍后相同體積下的冰淇淋質(zhì)量/g。

1.3.5 冰淇淋融化率的計(jì)算

參考何強(qiáng)等[24]的方法。取經(jīng)硬化的冰淇淋成品稱重后放置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中的金屬網(wǎng)上，金屬網(wǎng)下放置培養(yǎng)皿，計(jì)時(shí)30 min，測(cè)定落入培養(yǎng)皿中的冰淇淋融化的質(zhì)量，計(jì)算冰淇淋的融化率。

1.3.6 冰淇淋的感官評(píng)價(jià)

依據(jù)GB/T 31114—2014《冷凍飲品冰淇淋》略有調(diào)整，對(duì)冰淇淋的感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)分。邀請(qǐng)30位食品科學(xué)與工程專業(yè)的研究生(15名男生和15名女生)，在品嘗樣品前要用純凈水漱口，休息1 min，口中無余味后品嘗。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 添加限制性酶解亞麻籽蛋白冰淇淋的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.7 倒置熒光顯微鏡觀察方法

利用倒置熒光顯微鏡對(duì)融化狀態(tài)下冰淇淋中氣泡分布及形態(tài)進(jìn)行觀察，35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中融化，取適量融化的冰淇淋樣品固定于載玻片上，并利用CKX41倒置熒光顯微鏡(50倍)進(jìn)行觀察。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)均取3次測(cè)定平均值，數(shù)據(jù)處理采用Origin 2017和SPSS 16.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白功能特性的影響

由表2可以看出，限制性酶解能顯著提高亞麻籽蛋白的溶解性，酶解時(shí)間越長(zhǎng)溶解性越好；但對(duì)亞麻籽蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、持油性來說需要適度的水解，限制性酶解時(shí)間為5 min時(shí)乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性、持油性達(dá)到最高，限制性酶解時(shí)間為10 min時(shí)乳化性和起泡性達(dá)到最高；但限制性酶解會(huì)削弱亞麻籽蛋白的持水能力。證明適度的限制性酶解能顯著提高亞麻籽蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、持油性等功能特性，但降低其持水能力。

表2 限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白功能特性的影響

2.2 限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

2.2.1 圓二色譜(CD)分析

由表3可知隨著限制性酶解時(shí)間延長(zhǎng)亞麻籽蛋白的α-螺旋和無規(guī)卷曲質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加至8.37%和57.94%，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低至22.62%和11.07%。Zang等[25]研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)米糠蛋白隨著水解度由1%提高至6%，與原蛋白相比，α-螺旋質(zhì)量分?jǐn)?shù)由18.5%增加至21.6%，無規(guī)卷曲質(zhì)量分?jǐn)?shù)由24.6%增至34.7%，β-折疊質(zhì)量分?jǐn)?shù)由48.8%降至39.5%，β-轉(zhuǎn)角質(zhì)量分?jǐn)?shù)由8.1%降至4.0%。α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)靈活且開放，而β-折疊結(jié)構(gòu)則更穩(wěn)定[26]。表明限制性酶解導(dǎo)致亞麻籽蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)膨脹并更具柔韌性。

表3 限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.2 粒度分布分析

限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白的粒度分布和平均粒徑的影響如圖1、表4所示。從圖1可以看出，未限制性酶解的亞麻籽蛋白粒度分布范圍為1.5～473 μm，在164 μm附近觀察到峰，經(jīng)限制性酶解后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)出峰位置向較小粒徑方向移動(dòng)，限制性酶解至20 min時(shí)其出峰位置由未限制性酶解前的164 μm移至10 μm，表明粒徑較小的分子增多；從表4也可以看出，經(jīng)限制性酶解后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)平均粒徑逐漸降低，限制性酶解至20 min時(shí)其平均粒徑由未限制性酶解前的67.94 μm降低到42.68 μm。限制性酶解使亞麻籽蛋白粒徑變小，酶解時(shí)間越長(zhǎng)粒徑越小。徐紅華等[27]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、米曲霉蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶酶解至水解度為5%時(shí)，粒度均有不同程度的減小，這是由于限制性酶解將大粒徑蛋白分子酶解為小粒徑分子。

圖1 限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白粒徑分布的影響

表4 限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白平均粒徑的影響

2.2.3 表面巰基含量分析

通過測(cè)定限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白表面巰基含量，可以進(jìn)一步了解限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白結(jié)構(gòu)變化的影響，結(jié)果如表5所示。亞麻籽蛋白表面巰基含量為4.13 μmol/g。表面巰基含量隨著限制性酶解時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，限制性酶解時(shí)間為10 min時(shí)表面巰基含量達(dá)到最高。劉寧等[28]研究發(fā)現(xiàn)米渣蛋白經(jīng)限制性酶解后表面巰基含量較原蛋白顯著提高，可能是由于限制性酶解使蛋白質(zhì)分子展開，使存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的一些-SH暴露在其表面。但長(zhǎng)時(shí)間暴露可能會(huì)發(fā)生氧化作用使-SH氧化成二硫鍵，所以導(dǎo)致表面巰基含量逐漸降低[28-30]。

表5 限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白表面巰基含量的影響

2.2.4 表面疏水性分析

表面疏水性是判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象及功能特性變化的重要指標(biāo)之一[29]。限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白表面疏水性的影響如圖2所示。亞麻籽蛋白表面疏水性為3 740 630。表面疏水性隨著限制性酶解時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，限制性酶解時(shí)間為10 min時(shí)表面疏水性達(dá)到最高，為4 341 000。研究發(fā)現(xiàn)，魚糜蛋白、米糠蛋白分別經(jīng)堿性蛋白酶、胰蛋白酶水解后的表面疏水性隨著水解度的增加呈先增加后下降趨勢(shì)，這種增加可能是由于部分水解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，空間結(jié)構(gòu)展開并暴露出先前埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)，但隨著水解的進(jìn)行表面疏水值逐漸降低，可能歸因于酶解產(chǎn)生的游離疏水氨基酸和其不斷提升的疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)重新被包裹起來[25,31,32]。限制性酶解時(shí)間為5 min時(shí)表面疏水性比原蛋白顯著降低的原因，有待進(jìn)一步探討。

圖2 限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白表面疏水性的影響

2.2.5 掃描電鏡分析

蛋白粉體形狀及聚集情況可以通過掃描電鏡進(jìn)行觀察。限制性酶解時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白的掃描電鏡圖譜如圖3所示。與亞麻籽蛋白相比，限制性酶解亞麻籽蛋白的粉體狀態(tài)發(fā)生了顯著變化。未經(jīng)限制性酶解的亞麻籽蛋白粉體呈現(xiàn)大片狀結(jié)構(gòu)、表面相對(duì)平滑(圖3)。經(jīng)限制性酶解亞麻籽蛋白粉體隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)疏松多孔、碎片狀，酶解時(shí)間越長(zhǎng)觀察到越小的碎片。Jin等[33]也研究發(fā)現(xiàn)，用胰蛋白酶限制性酶解核桃蛋白其酶解后的結(jié)構(gòu)呈碎塊狀，疏松多孔。

圖3 限制性酶解亞麻籽蛋白粉體掃描電鏡圖(×1 500)

2.3 限制性酶解亞麻籽蛋白對(duì)軟質(zhì)冰淇淋品質(zhì)的影響

韓雅君[15]研究表明具有較高的乳化性和起泡性等功能特性的蛋白組分，適合添加在冰淇淋中。因此本研究選擇乳化性及起泡性較高的限制性酶解10 min的亞麻籽蛋白添加在冰淇淋中，考察其對(duì)冰淇淋品質(zhì)的影響。

軟質(zhì)冰淇淋品質(zhì)評(píng)定指標(biāo)主要包括感官評(píng)價(jià)、膨脹率和融化率。由表6可以看出隨著限制性酶解亞麻籽蛋白添加量的增加，冰淇淋感官評(píng)分值呈先增加后下降趨勢(shì)，當(dāng)添加量為4%時(shí)感官評(píng)分值達(dá)到最高為85.0分。劉麗等[34]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著大豆分離蛋白添加量的增加，冰淇淋的感官評(píng)分先升高后降低，這可能是由于過高的添加量使?jié){料黏度較高，導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)釋放較差，奶香味被掩蓋，使得感官評(píng)分降低。隨著添加量的增加冰淇淋的膨脹率呈逐漸上升趨勢(shì)、融化率呈逐漸下降趨勢(shì)，當(dāng)添加量為10%時(shí)膨脹率由48.99%提高至83.33%、融化率由87.48%降低至54.97%。徐瑩[35]研究發(fā)現(xiàn)，隨著酶法改性大豆蛋白添加量的增加，冰淇淋融化率降低。Chen等[36]利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶將大豆蛋白酶解后應(yīng)用于冰淇淋中，冰淇淋的融化速率也降低。這可能是添加酶法改性蛋白使冰淇淋黏度增加、冰晶粒徑減小，進(jìn)而減緩了冰淇淋融化。

表6 添加限制性酶解亞麻籽蛋白對(duì)冰淇淋感官品質(zhì)、膨脹率和融化率的影響

冰淇淋在融化狀態(tài)下氣泡大小是決定冰淇淋膨脹率的重要因素，冰淇淋在融化狀態(tài)下氣泡體積越大，冰淇淋膨脹率越高[37]。如圖4所示，未添加限制性酶解亞麻籽蛋白的冰淇淋融化狀態(tài)下的氣泡數(shù)量較少。當(dāng)添加不同質(zhì)量濃度的限制性酶解亞麻籽蛋白后，隨著添加量的增加大氣泡數(shù)量呈增加趨勢(shì)，表明冰淇淋的膨脹率隨著添加量的增加而提高。結(jié)果表明，添加限制性酶解亞麻籽蛋白可以改善膨脹率降低融化率，當(dāng)添加量為4%時(shí)可獲得品質(zhì)較好的軟質(zhì)冰淇淋。

圖4 添加限制性酶解亞麻籽蛋白制作的冰淇淋在融化狀態(tài)下氣泡分布情況

3 討論

經(jīng)限制酶解后亞麻籽蛋白的溶解性顯著提高，限制性酶解時(shí)間越長(zhǎng)溶解性越好。前人的研究表明蛋白質(zhì)分子溶解度與其粒徑有關(guān)，粒徑降低使蛋白質(zhì)的溶解度增加[25,38]。本研究結(jié)果顯示亞麻籽蛋白經(jīng)限制性酶解后其粒度較小的分子增多、平均粒徑降低，因此可以推測(cè)經(jīng)限制性酶解后亞麻籽蛋白的粒徑變小促使其溶解性得到改善。另一方面本研究還發(fā)現(xiàn)隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)其柔韌性越來越好，從而可以推測(cè)其溶解性可能與其柔韌性有關(guān)，柔韌性越好其溶解性越高，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

經(jīng)限制酶解后亞麻籽蛋白的持水性顯著降低，限制性酶解時(shí)間越長(zhǎng)持水性越差。前人的研究證實(shí)蛋白質(zhì)分子持水性與其分子質(zhì)量及黏度有關(guān)，蛋白分子經(jīng)酶解后，分子質(zhì)量與黏度降低，導(dǎo)致持水性降低[27]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)隨著限制性酶解時(shí)間的延長(zhǎng)亞麻籽蛋白粒徑即分子質(zhì)量降低，因此可以推測(cè)亞麻籽蛋白經(jīng)限制性酶解后其持水性下降的原因與其粒徑即分子質(zhì)量降低有關(guān)。經(jīng)限制性酶解后亞麻籽蛋白的黏度變化情況還有待進(jìn)一步探討。

亞麻籽蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增后降的趨勢(shì)，限制性酶解時(shí)間為5 min時(shí)乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最高，限制性酶解時(shí)間為10 min時(shí)乳化性和起泡性達(dá)到最高。前人的研究也顯示了類似的結(jié)果，葵花籽分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、米糠蛋白等經(jīng)酶解其乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性均呈現(xiàn)隨著水解度的提高先增后降的趨勢(shì)[11，12，25]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)亞麻籽蛋白經(jīng)限制性酶解酶解其粒徑越來越小、分子越來越具柔韌性、粉體狀態(tài)越來越呈較疏松多孔碎片狀，但表面巰基含量及表面疏水性呈先增后降趨勢(shì)，限制性酶解時(shí)間為10 min時(shí)表面巰基含量及表面疏水性達(dá)到最高。因此可以推測(cè)亞麻籽蛋白如要獲得較高的乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性需要適當(dāng)?shù)牧?、柔韌性，同時(shí)當(dāng)游離巰基含量、表面疏水性較高時(shí)相應(yīng)的可表現(xiàn)出較高的乳化性、起泡性。

亞麻籽蛋白的持油性呈先增加后下降趨勢(shì)。前人研究也顯示了類似結(jié)果，藍(lán)圓鲹分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解持油性也呈現(xiàn)先提高后降低趨勢(shì)[12]。有報(bào)道指出持油性的呈現(xiàn)較復(fù)雜，受蛋白含量、顆粒大小、表面性質(zhì)、疏水性等多方面因素的影響[39]。經(jīng)限制性酶解后亞麻籽蛋白的持油性先增后降的原因尚不明確，還有待進(jìn)一步探討。

植物源蛋白質(zhì)的功能特性的呈現(xiàn)非常復(fù)雜，受分子質(zhì)量、粒徑大小、表面疏水性等多方面因素的影響，任何加工條件的改變或結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化均導(dǎo)致其功能特性的變化，所以關(guān)于限制性酶解對(duì)亞麻籽蛋白功能特性的影響及其在各類食品中的應(yīng)用有待深入研究。

4 結(jié)論

限制性酶解改變了亞麻籽蛋白結(jié)構(gòu)，隨著限制性酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變更具柔韌性；粒徑逐漸降低；表面巰基含量及表面疏水值均呈先增加后降低趨勢(shì)；蛋白粉體狀態(tài)由較大平滑片狀變成了較小松散碎片狀。適度的限制性酶解能顯著提高亞麻籽蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、持油性等功能特性，但降低其持水能力。適量添加限制性酶解亞麻籽蛋白可以改善軟質(zhì)冰淇淋的感官品質(zhì)、提高其膨脹率、降低其融化率。