基于激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)的納米銀定性定量分析方法開發(fā)

陳晨 李永圓 王海霞 于洋 李正

摘要 目的：納米粒子特有的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)使得納米銀粒子具有廣譜抗菌活性。但納米銀粒子濃度過高可能會(huì)對(duì)其他細(xì)胞或器官等造成毒性或損傷，所以為了更好地發(fā)揮抗菌活性，對(duì)納米銀粒子進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析是極為必要的。方法：通過對(duì)納米銀粒子吸附方法和紙基芯片的優(yōu)化和篩選，測(cè)定納米銀粒子的激光誘導(dǎo)擊穿光譜圖。通過特征峰位與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)對(duì)納米銀粒子進(jìn)行定性分析，通過特征光譜強(qiáng)度與納米銀濃度的線性回歸關(guān)系建立納米銀粒子分析的定量模型。結(jié)果：通過重復(fù)3次“浸漬-干燥”工藝，定量濾紙表面吸附的納米銀粒子在328 nm、338 nm、520 nm、546 nm和827 nm處顯示出銀的特征峰。在312.5～5 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，520 nm波長(zhǎng)處納米銀的特征峰強(qiáng)與濃度呈良好線性關(guān)系（r=0.998 8）。結(jié)論：激光誘導(dǎo)擊穿光譜分析技術(shù)可用于納米銀定性定量分析，分析方法準(zhǔn)確，靈敏度高，且檢測(cè)過程方便便捷，易于實(shí)際推廣。

關(guān)鍵詞 激光誘導(dǎo)擊穿光譜;納米銀;定量分析;定性分析

Development of Qualitative and Quantitative Analysis Method of Silver Nanoparticles Based on Laser Induced Breakdown Spectroscopy

CHEN Chen1，LI Yongyuan1，WANG Haixia1，2，3，YU Yang1，2，3，LI Zheng1，2，3

（1 College of Pharmaceutical Engineering of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 2 State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 3 Haihe Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）

Abstract Objective：The unique small size effect and surface effect of nanoparticles make silver nanoparticles have broad-spectrum antibacterial activity.However，too high concentration of silver nanoparticles may cause toxicity or damage to other cells or organs.Therefore，in order to better exert antibacterial activity，it is extremely necessary to analyze silver nanoparticles quickly and accurately.Methods：By optimizing and screening the nano-silver particle adsorption method and paper-based chip，the laser-induced breakdown spectra of nano-silver particles were measured.The qualitative analysis of nano-silver particles was carried out by comparing the characteristic peak position with the standard spectral library，and the quantitative model of nano-silver particle analysis was established by the linear regression relationship between the characteristic spectral intensity and the concentration of nano-silver.Results：By repeating the “dipping-drying” process three times，the nano-silver particles adsorbed on the surface of the quantitative filter paper showed characteristic peaks of silver at 328 nm，338 nm，520 nm，546 nm and 827 nm.In the concentration range of 312.5～5 000 μg/mL，the characteristic peak intensity of nano-silver at the wavelength of 520 nm had a good linear relationship with the concentration （r=0.998 8）.Conclusion：The LIBS analysis technology can be used for qualitative and quantitative analysis of nano-silver.The analysis method is accurate and sensitive，and the detection process is convenient and convenient，which can be easily used in practice.

Keywords Laser induced breakdown spectroscopy; Nano-silver particles; Quantitative analysis; Qualitative analysis

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.004

納米銀顆粒具有廣譜抗菌活性，對(duì)多種革蘭陽(yáng)性、革蘭陰性細(xì)菌具有抑菌和殺菌作用[1]。據(jù)報(bào)道，納米銀粒子主要的抑菌機(jī)制是基于納米銀表面的陽(yáng)離子與細(xì)菌蛋白中的硫醇基團(tuán)間的特異性結(jié)合能力，在細(xì)菌表面黏附積累并穿透細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞成分被破壞，從而抑制或阻止細(xì)菌生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[2]。這種抑菌活性與納米銀顆粒的大小、形狀和濃度緊密相關(guān)，如果濃度過高，會(huì)對(duì)其他細(xì)胞或器官等造成毒性或嚴(yán)重?fù)p傷[3]。因此，對(duì)納米銀粒子建立準(zhǔn)確的分析方法對(duì)于其更好地發(fā)揮抗菌活性是極為必要的。

目前，對(duì)銀離子和單質(zhì)銀的定性和定量分析方法較為成熟，而對(duì)納米銀粒子的分析研究比較少。應(yīng)用于納米銀分析檢測(cè)的方法主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[4]、原子吸收光譜法（AAS）[5]、原子發(fā)射光譜法（AES）[6]、分光光度法[7]和電化學(xué)分析法[8]等。但上述方法均存在一定的缺陷，如ICP-MS方法測(cè)試成本高，普及化應(yīng)用程度低。AAS和AES方法都需要復(fù)雜的前處理工藝，耗時(shí)較長(zhǎng)。分光光度法受干擾因素較多，且對(duì)樣品濃度有一定限制。而電化學(xué)分析法穩(wěn)定性不高，靈敏度也有待于進(jìn)一步提高。因此，對(duì)納米銀的分析檢測(cè)方法不僅要求準(zhǔn)確度高，而且要便捷、易用，便于實(shí)際推廣。

本文采用激光誘導(dǎo)擊穿光譜（Laser Induced Breakdown Spectroscopy，LIBS）[9]技術(shù)用于納米銀的定性和定量分析研究。LIBS分析技術(shù)基于“蓄能-釋放”的模式，將高能量在很短的時(shí)間內(nèi)釋放出來，并在物體表面激發(fā)出瞬態(tài)等離子體并向外發(fā)射具有特定波長(zhǎng)的光，以此來對(duì)被測(cè)元素進(jìn)行分析，檢測(cè)靈敏度很高。每次檢測(cè)時(shí)間僅需一秒左右，方便快速且成本低廉，非常實(shí)用。所以這種方法在金屬元素的分析檢測(cè)方面引起了很多研究工作者的關(guān)注，但是在金屬納米材料，尤其是納米溶膠分析應(yīng)用方面的研究較少。因?yàn)檫@種技術(shù)在液體樣品分析時(shí)容易受到溶劑影響，影響檢測(cè)效果[10]。因此，如何把液體樣品分析轉(zhuǎn)化為固體樣品分析，是LIBS技術(shù)應(yīng)用于金屬納米溶膠樣品分析的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 激光誘導(dǎo)擊穿光譜（海洋光學(xué)亞洲公司，型號(hào)：LIBS-MX2500+）;電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，美國(guó)，型號(hào)：AB135-S）;臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）;紫外可見分光光度計(jì)（Agilent公司，美國(guó)，型號(hào)：Cary 8454）;動(dòng)態(tài)光散射納米粒徑儀（布魯克海文儀器公司，美國(guó)，型號(hào)：NanoBrook Omni 280137）;高分辨率透射電子顯微鏡（Hitachi公司，日本，型號(hào)：HT7700）;傅里葉變換紅外光譜儀（Shimadu公司，日本，型號(hào)：IRTracer-100）;純水機(jī)（北京頗爾過濾器有限公司，型號(hào)：Cascada Ⅰ）。

1.1.2 試劑 硝酸銀（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，批號(hào)：7761-88-8），檸檬酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：6132-04-3）。醋酸纖維素膜（NC膜，孔徑：0.22 μm，北京蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)：21174257）;慢性定性濾紙（=7 cm，灰分≤0.13，杭州特種紙業(yè)有限公司，批號(hào)：GS/T1914-2007）;慢性定量濾紙（=9 cm，灰分≤0.01，杭州特種紙業(yè)有限公司，批號(hào)：0428060216）;pH精密試紙（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F507LD0225）。實(shí)驗(yàn)用水為純水機(jī)制備的去離子水。

1.2 方法

1.2.1 納米銀顆粒的制備 將50 mL硝酸銀溶液（1 mmol/L）高溫加熱至沸騰后，緩慢滴加27 mL檸檬酸鈉溶液（質(zhì)量濃度為1%），并繼續(xù)攪拌直至溶液顏色變?yōu)辄S綠色。然后將溶液冷卻至室溫，經(jīng)多次離心分離去掉上清液得到納米銀溶膠，真空干燥后得到納米銀溶膠顆粒，并于4 ℃冰箱中在氮?dú)夥罩忻芊獗４妗?/p>

1.2.2 納米銀顆粒的表征 使用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)得到的納米銀溶膠進(jìn)行吸光度測(cè)試，運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）考察納米銀顆粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，并運(yùn)用高分辨率透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)納米銀溶膠的形貌進(jìn)行表征，通過動(dòng)態(tài)光散射納米粒徑儀（DLS）測(cè)量納米銀粒子的水合粒徑范圍。

1.2.3 檢測(cè)芯片篩選及制備 精密稱定納米銀固體顆粒10 mg，加入1 mL去離子水混勻后放入超聲機(jī)里分散成均勻溶液后取出得到濃度為10 000 μg/mL的供試品溶液。然后用去離子水逐級(jí)稀釋得到濃度為5 000 μg/mL、2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL和312.5 μg/mL的納米銀溶液。選取NC膜、pH精密試紙、定性濾紙和定量濾紙作為4種紙基芯片用于納米銀顆粒吸附。將這4種紙基芯片分別打孔制成直徑為0.8 cm的圓形紙片，將這4種芯片分別浸漬于特定濃度的納米銀溶液中，10 min后取出紅外燈烘干，此為“浸漬-干燥”過程，此過程分別重復(fù)1次、2次、3次，得到不同吸附次數(shù)的檢測(cè)芯片，考察不同紙基芯片的吸附效果及不同吸附過程的影響。

1.2.4 LIBS光譜校正及采集 在LIBS光譜采集前需要用空白芯片進(jìn)行校正。通過調(diào)整MVCMltDvc攝像頭軟件，固定激光與載物臺(tái)的垂直距離。再水平調(diào)整載物臺(tái)坐標(biāo)，使激光光束垂直且依次照射于檢測(cè)芯片的三等分面積內(nèi)，測(cè)試3次，記錄坐標(biāo)值。檢測(cè)芯片依據(jù)這3組坐標(biāo)值進(jìn)行LIBS光譜采集。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取5個(gè)濃度的納米銀供試品溶液各1 mL，將吸附效果最好的紙基芯片分別浸漬于不同濃度的供試品溶液中，通過“浸漬-干燥”過程后測(cè)量紙基芯片中納米銀顆粒的LIBS光譜。以濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，特征波峰處的峰強(qiáng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.2.5.2 精密度試驗(yàn) 將一個(gè)吸附效果最好的紙基芯片浸漬于625 μg/mL的供試品溶液中，重復(fù)3次“浸漬-干燥”過程后，在紙基芯片的不同位點(diǎn)處采集6次LIBS光譜，計(jì)算峰強(qiáng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

1.2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將一個(gè)吸附效果最好的紙基芯片浸漬于312.5 μg/mL的供試品溶液中，重復(fù)3次“浸漬-干燥”過程后，分別隔0、1、2、3 h后進(jìn)行LIBS光譜測(cè)試，并考察結(jié)果穩(wěn)定性。

1.2.5.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 平行選取六片吸附效果最好的紙基芯片，分布浸漬于6個(gè)同等濃度的納米銀溶膠（312.5 μg/mL）中，重復(fù)3次“浸漬-干燥”過程后，進(jìn)行LIBS光譜測(cè)試，并考察結(jié)果重現(xiàn)性。

1.2.5.5 加樣回收率 在1 mL濃度為1 250 μg/mL納米銀溶液中分別加入1 mL濃度為1 250 μg/mL、625 μg/mL，312.5 μg/mL的溶液，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次并計(jì)算濃度實(shí)測(cè)值，和理論濃度值做對(duì)比計(jì)算回收率。

2 結(jié)果

2.1 納米銀溶液表征 紫外-可見光譜圖可以看出納米銀粒子的吸收峰在417 nm處，與文獻(xiàn)中記錄的特征吸收波長(zhǎng)基本一致，說明通過化學(xué)反應(yīng)成功制備納米銀溶液。見圖1。納米銀粒子的TEM檢測(cè)結(jié)果可以看出納米銀的平均粒徑為60 nm，呈橢球形分布。見圖2。

通過DLS對(duì)合成的納米銀顆粒的水合粒徑進(jìn)行表征，從圖3可以看出合成的納米銀顆粒粒徑分布在35～75 nm之間，分布較寬。此外，采用FTIR技術(shù)對(duì)制備的納米銀顆粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。見圖4。納米銀在3 433 cm-1處的顯著吸收峰歸屬于O-H伸縮振動(dòng)，在1 581 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于C=O伸縮振動(dòng)，而在1 381 cm-1處的吸收峰代表C-H伸縮振動(dòng)[11]。

2.2 紙基芯片篩選 為了考察NC膜、pH精密試紙、定性濾紙和定量濾紙4種芯片的吸附性能，將混合紫薯紫染料后的納米銀溶膠滴于4種材質(zhì)的紙基芯片上，3 min后觀察吸附效果。pH試紙片上中心區(qū)域顏色較深，邊緣處淺，“咖啡環(huán)”明顯，說明擴(kuò)散不夠均勻。而納米銀顆粒在NC膜上擴(kuò)散速度很慢，擴(kuò)散效果也不好。相較于前二者，納米銀顆粒在定性濾紙和定量濾紙上擴(kuò)散較為均勻，但定性濾紙邊緣處可見一圈淺色帶，不如定量濾紙分布均勻。見圖5。

2.3 納米銀粒子的定性分析 納米銀粒子的LIBS光譜圖，其中*標(biāo)識(shí)的為納米銀粒子的特征峰，分別分布于328 nm、338 nm、520 nm、546 nm、827 nm波長(zhǎng)處，這5個(gè)特征峰位與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)中銀的特征峰位對(duì)應(yīng)，說明此種方法可以用于納米銀粒子的定性分析。見圖6。

2.4 浸漬工藝優(yōu)化 為了獲得均勻分布的載有納米銀粒子的檢測(cè)芯片，我們分別考察了4種紙基芯片對(duì)5個(gè)濃度梯度納米銀粒子（5 000 μg/mL、2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL和312.5 μg/mL）的吸附情況，每片芯片重復(fù)測(cè)定4次，理論上在5個(gè)特征吸收峰位處會(huì)得到100個(gè)測(cè)試數(shù)值。我們分別統(tǒng)計(jì)了4種紙基芯片在不同“浸漬-干燥”工藝次數(shù)下的測(cè)定結(jié)果。當(dāng)“浸漬-干燥”工藝為1次或2次時(shí)，均會(huì)出現(xiàn)測(cè)量結(jié)果數(shù)目缺失的情況，說明兩次“浸漬-干燥”工藝不完全，樣品分布不均勻。而當(dāng)工藝參數(shù)調(diào)整為3次時(shí)，不論哪種紙基芯片都能得到理論測(cè)試數(shù)值，說明3次“浸漬-干燥”工藝次數(shù)是必要且穩(wěn)定的操作參數(shù)。此外，定量濾紙的擴(kuò)散效果較好，即使經(jīng)過一次“浸漬-干燥”工藝也能得到全部的測(cè)試參數(shù)，但是為了得到穩(wěn)定的測(cè)試結(jié)果，我們選取三次“浸漬-干燥”工藝作為檢測(cè)芯片制備的關(guān)鍵工藝參數(shù)。見表1。

2.5 納米銀粒子的定量分析

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察 在5個(gè)濃度梯度的納米銀粒子溶液中，進(jìn)一步考察4種紙基芯片在5個(gè)特征峰位處的線性回歸關(guān)系。均經(jīng)過3次“浸漬-干燥”工藝處理后，不同芯片在各個(gè)特征波長(zhǎng)處的相關(guān)系數(shù)（r）值。見表2。據(jù)此依然可以看出，定量濾紙作為檢測(cè)芯片時(shí)，在各個(gè)特征波長(zhǎng)處獲得的定量關(guān)系效果最好。在328 nm、338 nm、520 nm、546 nm和827 nm波長(zhǎng)處，定量濾紙芯片上的檢測(cè)結(jié)果與納米銀溶膠濃度分布的線性關(guān)系見圖7（a～e）。

從圖7可以看出，520 nm波長(zhǎng)處的線性關(guān)系最好。所以選定“浸漬-干燥”工藝重復(fù)3次，檢測(cè)芯片為定量濾紙，520 nm波長(zhǎng)處的吸收峰作為納米銀定量測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)。520 nm處的LIBS峰強(qiáng)值與納米銀濃度關(guān)系的線性回歸方程為y=8.299 1x-1 658.5，r=0.998 8，線性范圍為312.5～5 000 μg/mL。此定量關(guān)系線性回歸關(guān)系好，波長(zhǎng)分布范圍寬，適宜做納米銀粒子的定量測(cè)試。

2.5.2 精密度 對(duì)在定量濾紙芯片上的6個(gè)不同位點(diǎn)處采集的特征峰值進(jìn)行分析，6個(gè)峰值的RSD值為3.47%，表明該測(cè)試方法具有良好的分析精密度。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)不同時(shí)間間隔下待測(cè)芯片上的特征峰強(qiáng)進(jìn)行分析，RSD值為1.6%，說明此測(cè)試芯片在3 h內(nèi)可保持?jǐn)?shù)據(jù)穩(wěn)定性。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)6片定量濾紙?jiān)谕葷舛鹊募{米溶膠中獲得的特征峰進(jìn)行分析，6個(gè)峰強(qiáng)的RSD值為2.74%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5.5 加樣回收率 3種加標(biāo)量對(duì)應(yīng)的樣品回收率分別為100.04%、99.62%、100.75%，平均加樣回收率為100.13%，RSD值小于2%，表明本方法準(zhǔn)確性高。見表3。

3 討論

為了實(shí)現(xiàn)水中納米銀粒子的超靈敏快速檢測(cè)，本文提出了一種基于激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)的納米銀定性定量分析方法，本方法采用紙基芯片作為測(cè)試載體，通過“浸漬-干燥”工藝將液體銀樣品轉(zhuǎn)化為固體樣品進(jìn)行測(cè)試。通過比較，定量濾紙的測(cè)試效果最好。定量濾紙表面吸附的納米銀粒子在328 nm，338 nm，520 nm，546 nm和827 nm處顯示出銀的特征峰。在520 nm處，納米銀的特征峰強(qiáng)度與濃度呈良好線性關(guān)系。本研究表明，通過合理的測(cè)試芯片選擇及優(yōu)化樣品前處理工藝，可以通過激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)納米銀粒子的定性定量分析，分析結(jié)果準(zhǔn)確，線性范圍寬。且測(cè)試時(shí)間短，方法便捷度高。未來，這種方法可以推廣到其他金屬的液體樣品測(cè)試分析中，為金屬樣品的快速、準(zhǔn)確分析提供新的思路和方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Spagnoletti FN，Spedalieri C，Kronberg F，et al.Extracellular biosynthesis of bactericidal Ag/AgCl nanoparticles for crop protection using the fungus Macrophomina phaseolina[J].J Environ Manage，2019，231：457-466.

[2]Das CGA，Kumar VG，Dhas TS，et al.Antibacterial activity of silver nanoparticles（biosynthesis）：A short review on recent advances[J].Biocatal Agric Biotechnol，2020，27：101593.

[3]Kathiravan V，Ravi S，Ashokkumar S.Synthesis of silver nanoparticles from Melia dubia leaf extract and their in vitro anticancer activity[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2014，130：116-121.

[4]Hampton JO，Specht AJ，Pay JM，et al.Portable X-ray fluorescence for bone lead measurements of Australian eagles[J].Sci Total Environ，2021，789：147998.

[5]Kasa NA，Sel S，Chormey DS，et al.Determination of cadmium at trace levels in parsley samples by slotted quartz tube-flame atomic absorption spectrometry after preconcentration with cloud point extraction[J].Measurement，2019，147：106841.

[6]Guo C，Lv L，Liu Y，et al.Applied Analytical Methods for Detecting Heavy Metals in Medicinal Plants[J].Crit Rev Anal Chem，2021：1-21.

[7]Cao YL，Liu GQ，Qin XT，et al.Preparation and application of 2-chlorophenol molecularly imprinted photonic crystal hydrogel sensor[J].J Macromol Chem，2021，58（5）：336-343.

[8]Li Z，Zhu M.Detection of pollutants in water bodies：electrochemical detection or photo-electrochemical detection？[J].Chem Commun，2020，56（93）：14541-14552.

[9]Fabre C.Advances in Laser-Induced Breakdown Spectroscopy analysis for geology：A critical review[J].Spectrochim Acta，Part B，2020，166：105799.

[10]楊宇翔.水中痕量有害重金屬的LIBS-LIF超靈敏檢測(cè)[D].廣州：華南理工大學(xué)，2018.

[11]Bhanumathi R，Manivannan M，Thangaraj R，et al.Drug-Carrying Capacity and Anticancer Effect of the Folic Acid-and Berberine-Loaded Silver Nanomaterial To Regulate the AKT-ERK Pathway in Breast Cancer[J].ACS Omega，2018，3（7）：8317-8328.

（2021-10-25收稿 責(zé)任編輯：王明）