基于核磁共振氫譜的組學(xué)技術(shù)在中藥制藥過程研究中的應(yīng)用與展望

趙芳 李文竹 潘堅揚 楊嘉譽 瞿海斌

摘要 中藥制藥過程工藝復(fù)雜，過程控制水平與產(chǎn)品質(zhì)量直接相關(guān)。進行制藥過程質(zhì)量評價與質(zhì)量控制研究，提高制藥過程理解，對保證中藥制劑的安全性與有效性具有重要的意義。隨著核磁共振技術(shù)的發(fā)展，核磁共振氫譜已在中藥質(zhì)量評價與代謝組學(xué)研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本文主要介紹了氫核磁共振組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中藥炮制、提取等制藥過程研究時，在辨識過程化學(xué)標(biāo)志物、研究代謝物在過程中的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移規(guī)律等方面的應(yīng)用進展，同時展望了基于氫核磁共振技術(shù)的過程組學(xué)研究在中藥制藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 核磁共振氫譜;組學(xué)技術(shù);中藥;制藥過程;質(zhì)量控制

Application and Prospects of 1H NMR-based Omics Study in Pharmaceutical Processes of Traditional Chinese Medicine

ZHAO Fang1，2，3，LI Wenzhu1，2，PAN Jianyang1，2，YANG Jiayu1，2，QU Haibin1，2

（1 Pharmaceutical Informatics Institute，College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China; 2 Innovation Center in Zhejiang University，State Key Laboratory of Component-Based Chinese Medicine，Hangzhou 310058，China; 3 Hisun Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Hangzhou 311400，China）

Abstract The pharmaceutical process of Chinese medicinal is complex，and the level of process control is directly related to product quality.Carrying out research on the quality evaluation and quality control of the pharmaceutical process and improving the understanding of the pharmaceutical process are of great significance to ensure the safety and effectiveness of Chinese medicinal preparations.With the development of nuclear magnetic resonance technology，hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy has been widely used in the fields of quality evaluation of Chinese medicinal and metabolomics research.This paper mainly introduces the application progress of proton nuclear magnetic resonance omics technology in the research of Chinese medicinal processing，extraction and other pharmaceutical processes，identifying process chemical markers，studying the transformation and transfer law of metabolites in the process，etc.The application prospect of process omics research of proton nuclear magnetic resonance （1H NMR） in the field of traditional Chinese medicine and pharmaceuticals.

Keywords Proton nuclear magnetic resonance （1H NMR）; Omics technology; Chinese medicinal; Pharmaceutical process; Quality control

中圖分類號：R282.4文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.002

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技術(shù)最早被應(yīng)用于天然產(chǎn)物領(lǐng)域是在20世紀(jì)60年代。數(shù)十年來，NMR技術(shù)的應(yīng)用范圍得到了不斷拓展。作為一種全面的化學(xué)信息獲取技術(shù)，NMR能夠用于高通量、定性定量分析中藥制劑及其生產(chǎn)過程中間體的多類化學(xué)成分，在有機和生化分子的識別和結(jié)構(gòu)鑒定，復(fù)雜混合物中各個化合物的精確定量測定和多組分分析，以及與化學(xué)計量學(xué)技術(shù)結(jié)合的代謝組學(xué)研究發(fā)揮了極大的作用。

在中成藥生產(chǎn)過程中，各工藝單元中發(fā)生的化學(xué)物質(zhì)組成變化不清是導(dǎo)致中成藥質(zhì)量難控的根本原因之一。本文就基于核磁共振氫譜（1H Nuclear Magnetic Resonance Spectra，1H NMR）技術(shù)的組學(xué)分析在中藥制藥過程研究中的應(yīng)用及展望進行綜述。

1 中藥制藥過程質(zhì)量控制

為克服現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足，提高質(zhì)量一致性、可控性和溯源性，劉昌孝院士提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Quality Marker，Q-Marker）的概念[1]，明確了Q-Marker應(yīng)具有“存在性”“特有性”“可測性”“功效關(guān)聯(lián)性”以及“溯源和傳遞性”5大特點，進一步明確了中藥質(zhì)量認(rèn)識、質(zhì)量評價和質(zhì)量控制應(yīng)著眼于中藥形成全過程的質(zhì)量屬性及物質(zhì)基礎(chǔ)的復(fù)雜、動態(tài)變化規(guī)律，即質(zhì)量“傳遞與溯源”的要求，以期實現(xiàn)闡明最終藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和建立可溯源的全程質(zhì)量控制體系的目的[2]。中藥所含的化學(xué)成分較為復(fù)雜，在臨床上應(yīng)用時，多種成分協(xié)同起效，但也有一些成分可能導(dǎo)致不良反應(yīng)的產(chǎn)生，因此僅對少數(shù)幾個藥效成分的檢測和控制并不能保證中藥的安全性。一些中藥特殊劑型，如中藥注射液，其冗長的、復(fù)雜的生產(chǎn)工藝流程中，各工藝單元中化學(xué)物質(zhì)組成變化不清，同時存在藥材質(zhì)量的批次或產(chǎn)地等差異，制藥過程全成分監(jiān)測困難，過程理解不易，導(dǎo)致其質(zhì)量控制難度大大提高[3-4]。藥品質(zhì)量源于設(shè)計（Quality by Design）[5]的理念已在中藥領(lǐng)域引起廣泛重視，通過獲取中藥制藥過程各工藝單元化學(xué)信息，分析各工藝單元前后綜合化學(xué)信息與關(guān)鍵質(zhì)量屬性的變化情況，揭示生產(chǎn)工藝的內(nèi)在規(guī)律，提高中藥制藥的過程理解，進而實現(xiàn)過程控制，使制藥過程波動與風(fēng)險可控，是進一步提高中藥質(zhì)控水平、推進中藥制造智能化的重要途徑。

隨著分析化學(xué)、計算機輔助技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)的迅猛發(fā)展，中藥質(zhì)量分析技術(shù)已逐步發(fā)展為定量分析（藥效成分、活性成分、指標(biāo)成分或主要化學(xué)成分，以及有毒有害成分）與色譜指紋圖譜、紅外（Infrared，IR）、近紅外（Near-infrared，NIR）等光譜分析并重的質(zhì)量分析模式[6-7]?，F(xiàn)行的中藥質(zhì)量分析著眼于藥效成分、活性成分、指標(biāo)成分或主要化學(xué)成分的定量分析及指紋圖譜相似度評價，主要采用色譜分析技術(shù)，而針對中藥制劑中的糖類、氨基酸、有機酸、核苷等初生代謝產(chǎn)物的檢測與控制則較為少見。

針對中藥制劑中初生代謝物的分析，高通量的核磁共振技術(shù)進入了研究人員的視野[8-9]。1H NMR波譜中，相應(yīng)信號的位置和強弱反映了檢測對象中含氫元素的代謝物的結(jié)構(gòu)特征和相對含量[10]，是有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定、反應(yīng)動力學(xué)研究及植物代謝組學(xué)研究等領(lǐng)域的重要技術(shù)方法。PMR在中藥材、中藥提取物及中藥制劑的研究中具有諸多優(yōu)點[11-15]：樣品無需復(fù)雜預(yù)處理，前處理簡便且能夠保留待測樣品的理化特征;分析脈沖多樣化，檢測適用范圍廣;分析過程快速;光譜化學(xué)信息豐富，可解釋性高;通過內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)法輔助可實現(xiàn)定量核磁共振（Quantitative Nuclear Magnetic Resonance，qNMR）分析技術(shù);NMR儀器性能穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，精密度高，構(gòu)建的方法穩(wěn)健性強。綜上所述，NMR技術(shù)在中藥制藥過程全成分分析中優(yōu)勢顯著，適合作為中藥制劑生產(chǎn)過程質(zhì)量控制方法研究的有力工具。

2 基于1H NMR組學(xué)技術(shù)的中藥制藥過程分析

近年來，基于NMR技術(shù)的植物代謝組學(xué)研究發(fā)展飛速，也在中藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[13，16-17]。植物代謝組學(xué)通過檢測并分析植物體在內(nèi)、外因刺激施加前后的代謝物狀態(tài)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析與模式識別技術(shù)，量化并解釋內(nèi)外因?qū)е碌闹参矬w代謝變化，進而發(fā)現(xiàn)代謝過程的關(guān)鍵生物標(biāo)志物（Bio-marker）及其代謝通路，為探究中藥的重要次級代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)化、積累規(guī)律與機制等提供了有效的方法，為提高中藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量提供了理論參考。對于中藥制藥過程，可參考代謝組學(xué)的基本流程與分析手段，構(gòu)建中藥制藥過程組學(xué)方法，即通過中藥制藥過程代表性樣本采集、NMR分析與數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、化學(xué)計量學(xué)分析、化學(xué)標(biāo)志物（Chemical-marker）篩選等，對工藝中間體化學(xué)組成進行全面分析，闡明中藥中各類代謝物在制藥過程中各工藝環(huán)節(jié)內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律，促進對制藥過程的科學(xué)理解，探究工藝過程的本質(zhì)?；贜MR的中藥制藥過程組學(xué)分析流程。見圖1。

2.1 過程工藝中間體的獲取 對中藥制藥過程進行組學(xué)分析，首先需要獲取相應(yīng)工藝過程的原料與產(chǎn)物，即過程中間體（Process Intermediates）。對于制藥過程的組學(xué)研究，可在工業(yè)規(guī)模下的生產(chǎn)過程中進行定點取樣，獲取過程中間體并留樣分析;也可在直接小試或者中試規(guī)模下進行工藝模擬，制備得到過程中間體并進行NMR分析。

2.2 測試樣品的配制 根據(jù)待測工藝中間體的溶劑極性及成分屬性，選擇合適的氘代試劑對樣品進行化學(xué)標(biāo)記。部分樣品可直接加入一定比例的氘代試劑后進行NMR分析;部分樣品需要進行簡單的預(yù)處理，以提高代謝物的信號響應(yīng)，或避免原始樣品中的溶劑信號對代謝物信號產(chǎn)生干擾。如，部分中藥制藥工藝需要使用乙醇作為溶媒，此類樣品若直接進行NMR分析，則采集到的NMR光譜中乙醇的特征信號響應(yīng)極強，其余代謝物的信噪比將受到顯著影響，不利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。針對此類樣品，可通過真空凍干或真空離心濃縮等方式揮干溶劑，再使用氘代甲醇或氘代水將樣品復(fù)溶后進行NMR分析。

2.3 NMR光譜的采集及處理 在NMR光譜采集過程中，為獲得化學(xué)信息豐富的NMR圖譜，需要優(yōu)化儀器操作程序與采集參數(shù)，如勻場程序、溫度控制、數(shù)據(jù)采集時間、脈沖角、分辨率、激發(fā)偏置（O1P）、弛豫延遲時間（D1）、采集次數(shù)（NS）以及接收器增益值（RG）等，進行選擇與優(yōu)化。如，樣品濃度偏低時，可以通過提高RG及增加NS;選擇合適的D1（D1應(yīng)該是自旋晶格弛豫T1的7倍以上）以保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性;將O1P設(shè)置于全譜的中心，以避免邊緣信號的形變;優(yōu)化采集溫度，避免樣品在光譜采集過程中持續(xù)受熱，導(dǎo)致信號漂移、信噪比降低[18]。由于不同樣品的原始NMR光譜間可能存在的信號漂移、線寬變化等差異，不利于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，因此還需對光譜進行預(yù)處理，包括充零、相位矯正、基線校正、信號對齊、分箱（Binning）處理、譜線解卷積或線性擬合、調(diào)整譜線增寬（LB）參數(shù)、信號對齊等，使得不同樣品間的光譜基線形態(tài)、信號分布、峰形與峰寬等實現(xiàn)相對一致，提高不同樣品NMR光譜間的可比性，減小系統(tǒng)誤差，提高定量結(jié)果準(zhǔn)確性。如，中藥制劑成分復(fù)雜，NMR光譜中常有多個代謝物的部分結(jié)構(gòu)與氫原子化學(xué)環(huán)境相似，對應(yīng)的特征信號發(fā)生重疊，對后續(xù)分析產(chǎn)生干擾，此時需要通過線性擬合或解卷積獲取單個特征峰的準(zhǔn)確峰面積[19];同類樣品間的pH值與離子濃度可能因為代謝物濃度、比例的不同而存在差異，導(dǎo)致NMR光譜間存在代謝物特征峰偏移，此時可采用CluPA[20]或ICOSHIFT[21]等方法進行光譜對齊。

2.4 化學(xué)計量學(xué)分析 過程中間體的NMR光譜經(jīng)處理后得到數(shù)據(jù)矩陣X（m×n）用于化學(xué)計量學(xué)分析，其中為m工藝中間體的數(shù)量，n為變量數(shù)（NMR光譜經(jīng)降維處理后的數(shù)據(jù)點數(shù)）。常用的化學(xué)計量學(xué)方法包括非監(jiān)督的模式識別法，如主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、層次聚類分析（Hierarchical Classification Analysis，HCA）方法，以及有監(jiān)督的模式識別方法，如偏最小二乘判別分析法（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）或正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least Square-Discriminant Analysis，OPLS-DA）等[22]。其中，PCA和HCA通常用于獲取所有樣本的全局分布概貌，通過得分圖等工具進行無監(jiān)督的分類來觀察不同樣品之間的異同，從而分析不同工藝條件對樣品化學(xué)組成的影響;PLS-DA和OPLS-DA等則基于既定的樣本類別建立模型，進而通過相應(yīng)統(tǒng)計量來辨識模型的關(guān)鍵變量，并通過光譜信號歸屬確定這些變量所對應(yīng)的代謝物，將其視作相應(yīng)過程的潛在化學(xué)標(biāo)志物，認(rèn)為這些代謝物在該工藝過程中變化較大，存在著可能的轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，是潛在的工藝中間體關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

2.5 過程表征與過程理解 基于對過程化學(xué)標(biāo)志物的辨識結(jié)果，通過對相應(yīng)NMR信號峰進行解卷積積分，對化學(xué)標(biāo)志物進行定量或半定量分析，獲得代謝物在過程中的含量變化趨勢，辨析不同工藝過程及過程參數(shù)對代謝物的影響程度，從而對其在制藥過程中的溶出、沉淀、降解、聚合等轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化規(guī)律進行推斷，即可在代謝物層面實現(xiàn)對工藝過程的表征，進而加深對工藝過程的理解。

3 基于NMR的組學(xué)技術(shù)在中藥制藥過程中的應(yīng)用

中藥炮制過程是中藥材增效減毒的重要手段。在炮制過程中，中藥化學(xué)成分經(jīng)常發(fā)生變化，炮制品的質(zhì)量關(guān)乎中醫(yī)藥臨床療效的發(fā)揮[23]。NMR技術(shù)應(yīng)用于炮制過程研究時，有助于加深對炮制前后藥品成分變化的認(rèn)識，挖掘炮制前后中藥材的藥效或活性差異的內(nèi)在原因。Li等[24]采用NMR技術(shù)研究了柴胡的醋制過程，通過對不同醋制前后柴胡樣品的1H NMR光譜數(shù)據(jù)的多變量分析，解析了由醋制引起的柴胡中10種初生代謝物與6種次生代謝物的變化，并闡述了不同醋制條件對柴胡中代謝物含量的影響規(guī)律。Zhao等[25-26]對金銀花的炒炭法炮制過程進行了研究，分析金銀花經(jīng)過不同溫度及時間的碳制處理后NMR光譜中各特征信號，通過熱圖分析法及PCA得分圖定性分析碳制工藝過程中特征信號的變化規(guī)律;在此基礎(chǔ)上，通過柱色譜法分離了5個特征代謝物，分別為綠原酸、肌醇、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C，并定量分析其在不同加熱條件下的變化規(guī)律。Zhai等[27]通過辨識白術(shù)經(jīng)麩炒后其1H NMR光譜中特征信號的變化，發(fā)現(xiàn)并鑒定了5個新特征代謝物，并解析了特征代謝物的結(jié)構(gòu)與來源。Li等[28]基于1H NMR光譜分析了鹿茸中52種常見代謝物在經(jīng)熱水煮炸法炮制后的變化情況，采用PCA及OPLS-DA法辨識出過程的11個化學(xué)標(biāo)志物，包括丙氨酸、苯丙氨酸、尿苷、尿嘧啶、膽汁酸、膽堿等。王雪潔等[29]對生遠志、蜜遠志和甘草制的遠志進行了1H NMR代謝組學(xué)分析，證明了炮制會改變遠志的藥用特性;Dai等[30]采用NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究不同干燥方式下丹參藥材中次級代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)晾干能夠促進莽草酸介導(dǎo)的多酚酸類成分的合成，而曬干會抑制多酚酸的產(chǎn)生;李藝等[31]采用基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析對細辛及米醋制細辛、老陳醋制細辛的化學(xué)成分進行比較分析，從而探究傳統(tǒng)理論中細辛入藥時需用老陳醋炮制的理論依據(jù);李震宇等[32]采用方差分析及OPLS-DA法對白芍及其2種醋制品的化學(xué)成分進行了比較分析，探討了炮制用醋種類對白芍醋制后化學(xué)成分的影響。此外，對于黃芪[33]、地黃[34]、款冬花[35]、大海馬[36]、柴胡[37]以及王不留行[38]等中藥的炮制過程，也有研究者開展了基于1H NMR組學(xué)技術(shù)的代謝物變化研究。以上研究均表明基于NMR技術(shù)，可以闡釋炮制工藝過程中多類別特征代謝物變化規(guī)律，能夠為中藥炮制工藝現(xiàn)代化標(biāo)準(zhǔn)加工規(guī)程與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供新的思路與方法。

中成藥制備過程經(jīng)常包含提取、濃縮、醇沉等工藝單元，由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，目前對這些工藝單元開展中藥制藥過程組學(xué)研究還不多。Li等[39]在丹參提取工藝表征研究中引入組學(xué)分析技術(shù)，以1H NMR光譜為分析工具，對不同組成溶媒提取的丹參提取物進行質(zhì)量表征，采用PCA、OPLS-DA和HCA等多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)，解釋了丹參提取液中各類代謝物的濃度隨乙醇濃度的變化趨勢，并通過OPLS-DA法識別出不同溶劑中的溶出規(guī)律有顯著不同的代謝物，將其視作過程表征中的特征代謝物。在此基礎(chǔ)上，基于光譜解卷積技術(shù)，使用半定量1H NMR方法獲得了特征代謝物的相對濃度信息，進一步說明了不同溶劑組間的代謝物溶出規(guī)律變化。該研究表明了基于NMR技術(shù)的中藥制藥過程組學(xué)方法可表征中藥提取過程，幫助闡明代謝物在提取工藝中溶出規(guī)律。Zhao等[40]通過對丹參川芎嗪注射液生產(chǎn)過程中工藝中間體的1H NMR光譜進行HCA、OPLS-DA分析，辨識生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵質(zhì)控工藝，以及相關(guān)工藝的潛在化學(xué)標(biāo)志物。此外，Zhao等[41]以基于1H NMR的OPLS-DA法辨識了丹參醇沉工藝的化學(xué)標(biāo)志物，在此基礎(chǔ)上結(jié)合實驗設(shè)計法（Design of Experiment，DoE）獲取具有代表性的醇沉上清液，基于半定量1H NMR法考察不同的工藝參數(shù)對化學(xué)標(biāo)志物在醇沉工藝中保留情況的影響。以上研究說明NMR光譜法具有揭示中藥生產(chǎn)全過程中各類化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化規(guī)律及識別潛在化學(xué)標(biāo)志物的能力。

4 展望

將基于1H NMR的組學(xué)技術(shù)引入到中藥制藥過程研究中，通過獲取中藥制劑及工藝中間體的NMR分析數(shù)據(jù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及NMR化合物信息，可發(fā)現(xiàn)中藥制劑及工藝中間體中所含的化學(xué)成分，結(jié)合基于化學(xué)計量學(xué)與模式識別等多變量數(shù)據(jù)分析工具，可用于全面、整體、定量地評估各類初生、次生代謝物在制藥過程中的動態(tài)變化，發(fā)掘各工藝單元中化學(xué)標(biāo)志物，闡明其轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化規(guī)律，同時有助于考察各工藝條件對化學(xué)標(biāo)志物的影響程度及影響規(guī)律，以實現(xiàn)對化學(xué)標(biāo)志物的全過程追溯。

基于1H NMR的制藥過程組學(xué)技術(shù)，將有望為中藥生產(chǎn)過程表征以及深入過程理解提供方法，包括但不限于構(gòu)建中成藥代謝物NMR數(shù)據(jù)庫，生藥炮制工藝的研究與優(yōu)化，中成藥制藥過程全流程Q-Marker及其他化學(xué)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化規(guī)律研究，基于qNMR技術(shù)的工藝過程監(jiān)測與過程控制，工藝表征與工藝優(yōu)化，中藥制劑貯存過程全成分轉(zhuǎn)化、降解規(guī)律研究等。這為探究工藝過程的本質(zhì)，為制定與提升中藥制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考，在中藥制藥過程研究中具有較大的研究價值與應(yīng)用前景。

參考文獻

[1]Liu C，Cheng Y，Guo D，et al.A New Concept on Quality Marker for Quality Assessment and Process Control of Chinese Medicines[J].Chin Herb Med，2017，9（1）：3-13.

[2]趙鴻鵬，許浚，張洪兵，等.基于質(zhì)量傳遞與溯源的中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的發(fā)現(xiàn)策略及應(yīng)用[J].中草藥，2021，52（9）：2557-2565.

[3]Houson I.Process Understanding：For Scale-Up and Manufacture of Active Ingredients[M].Hoboken：Wiley-VCH，2011：255-281.

[4]張伯禮，范驍輝，劉洋，等.中成藥二次開發(fā)戰(zhàn)略及其核心技術(shù)體系[J].中國中藥雜志，2013，38（22）：3797-3800.

[5]龔行楚，陳滕，瞿海斌.基于質(zhì)量源于設(shè)計理念的中成藥二次開發(fā)研究進展[J].中國中藥雜志，2017，42（6）：1031-1036.

[6]Li P，Qi L，Liu E，et al.Analysis of Chinese herbal medicines with holistic approaches and integrated evaluation models[J].TrAC Trends Analyt Chem，2008，27（1）：66-77.

[7]Alaerts G，Dejaegher B，Smeyers-Verbeke J，et al.Recent developments in chromatographic fingerprints from herbal products：set-up and data analysis[J].Comb Chem High Throughput Screen，2010，13（10）：900-922.

[8]Xie J，Zhang A，Sun H，et al.Recent advances and effective strategies in the discovery and applications of natural products[J].Rsc Adv，2018，8（2）：812-824.

[9]Halabalaki M，Vougogiannopoulou K，Mikros E，et al.Recent advances and new strategies in the NMR-based identification of natural products[J].Curr Opin Biotechnol，2014，25：1-7.

[10]Huang T，Li H，Zhang W，et al.Advanced approaches and applications of qNMR[J].Metrologia，2020，57（1）：14004.

[11]Schripsema J.Application of NMR in plant metabolomics：techniques，problems and prospects[J].Phytochem Anal，2010，21（1）：14-21.

[12]Putri SP，Nakayama Y，Matsuda F，et al.Current metabolomics：practical applications[J].J Biosci Bioeng，2013，115（6）：579-589.

[13]Carlomagno T.NMR in natural products：understanding conformation，configuration and receptor interactions[J].Nat Prod Rep，2012，29（5）：536-554.

[14]Pauli GF，Jaki BU，Lankin DC.Quantitative 1H NMR：development and potential of a method for natural products analysis[J].J Nat Prod，2005，68（1）：133-149.

[15]劉霞，王映紅.基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)在藥用植物研究中的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報，2017，52（4）：541-549.

[16]Kim HK，Choi YH，Verpoorte R.NMR-based metabolomic analysis of plants[J].Nat Protoc，2010，5（3）：536-549.

[17]Valentino G，Graziani V，D′Abrosca B，et al.NMR-based Plant Metabolomics in Nutraceutical Research：An Overview[J].Molecules，2020，25（6）：1444.

[18]Saito T，Nakaie S，Kinoshita M，et al.Practical guide for accurate quantitative solution state NMR analysis[J].Metrologia，2004，41（3）：213-218.

[19]Mihaleva VV，Korhonen SP，van Duynhoven J，et al.Automated quantum mechanical total line shape fitting model for quantitative NMR-based profiling of human serum metabolites[J].Anal Bioanal Chem，2014，406（13）：3091-3102.

[20]Vu TN，Valkenborg D，Smets K，et al.An integrated workflow for robust alignment and simplified quantitative analysis of NMR spectrometry data[J].BMC Bioinformatics，2011，12：405.

[21]Savorani F，Tomasi G，Engelsen SB.icoshift：A versatile tool for the rapid alignment of 1D NMR spectra[J].J Magn Reson，2010，202（2）：190-202.

[22]Uarrota VG，Moresco R，Coelho B，et al.Metabolomics combined with chemometric tools（PCA，HCA，PLS-DA and SVM） for screening cassava（Manihot esculenta Crantz） roots during postharvest physiological deterioration[J].Food Chem，2014，161：67-78.

[23]孫娥，徐鳳娟，張振海，等.中藥炮制機制研究進展及研究思路探討[J].中國中藥雜志，2014，39（3）：363.

[24]Li ZY，Sun HM，Xing J，et al.Chemical and biological comparison of raw and vinegar-baked Radix Bupleuri[J].J Ethnopharmacol，2015，165：20-28.

[25]Zhao J，Wang M，Avula B，et al.Effect of Processing on the Traditional Chinese Herbal Medicine Flos Lonicerae：An NMR-based Chemometric Approach[J].Planta Med，2015，81（9）：754-764.

[26]Zhao J，Wang M，Avula B，et al.Change of chemical composition in Flos lonicerae：An investigation of herbal processing（PAO ZHI） using NMR spectroscopy[J].Planta Med，2015，81（11）：888-897.

[27]Zhai C，Zhao J，Chittiboyina AG，et al.Newly generated atractylon derivatives in processed Rhizomes of Atractylodes macrocephala Koidz[J].Molecules，2020，25（24）：5904.

[28]Li J，Sun H，Bian X，et al.Research on mechanism of traditional hot processing on velvet antler based on 1H nuclear magnetic resonance and multivariate statistical analysis[J].Pharmacogn Mag，2019，15（63）：378-384.

[29]王雪潔，李震宇，薛水玉，等.基于植物代謝組學(xué)技術(shù)的遠志不同炮制品質(zhì)量控制研究[J].中草藥，2012，43（9）：1727-1737.

[30]Dai H，Xiao C，Liu H，et al.Combined NMR and LC-MS analysis reveals the metabonomic changes in Salvia miltiorrhiza Bunge induced by water depletion[J].J Proteome Res，2010，9（3）：1460-1475.

[31]李藝，范瑪莉，邢婕，等.龜齡集中細辛特殊炮制工藝的代謝組學(xué)研究[J].中草藥，2015，46（16）：2385-2393.

[32]李震宇，范瑪莉，秦雪梅.基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)的白芍及其醋制品的化學(xué)比較[J].藥學(xué)學(xué)報，2015，50（2）：211-217.

[33]Jung JY，Jung Y，Kim JS，et al.Assessment of peeling of Astragalus roots using 1H NMR-and UPLC-MS-based metabolite profiling[J].J Agric Food Chem，2013，61（43）：10398-10407.

[34]He P，Li Z，Xing J，et al.1H NMR based metabolic profiling of the processing effect on Rehmanniae Radix[J].Anal Methods，2014，6（8）：2736-2744.

[35]李娟，張松，秦雪梅，等.基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)的款冬花生品與蜜炙品化學(xué)成分比較[J].中草藥，2015，46（20）：3009-3016.

[36]趙曉喆.基于代謝組學(xué)技術(shù)研究不同海馬商品藥材化學(xué)成分差異性[D].太原：山西大學(xué)，2018.

[37]孫慧敏.柴胡醋制前后的化學(xué)及藥理比較研究[D].太原：山西大學(xué)，2015.

[38]周國洪.王不留行化學(xué)成分及炮制對其影響研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2016.

[39]Li W，Zhao F，Pan J，et al.Influence of ethanol concentration of extraction solvent on metabolite profiling for Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma extract by 1H NMR spectroscopy and multivariate data analysis[J].Process Biochem，2020，97（1）：158-167.

[40]Zhao F，Li W，Pan J，et al.A novel critical control point and chemical marker identification method for the multi-step process control of herbal medicines via NMR spectroscopy and chemometrics[J].Rsc Adv，2020，10（40）：23801.

[41]Zhao F，Li W，Pan J，et al.Process characterization for ethanol precipitation of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma（Danshen） using 1H NMR spectroscopy and chemometrics[J].Process Biochem，2021，101（1）：218-229.

（2021-10-25收稿 責(zé)任編輯：王明）