基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的淫羊藿增強(qiáng)免疫功能作用機(jī)制研究

梁彪 高家治 徐朝輝 王建東 施展

摘要 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討淫羊藿增強(qiáng)免疫功能可能的作用機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索淫羊藿的活性成分和靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。通過人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）檢索免疫抑制的相關(guān)靶點(diǎn)，利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，利用DAVID平臺進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集通路分析。結(jié)果：篩選出淫羊藿21個有效活性成分，179個潛在靶點(diǎn)。GO生物過程共562條，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、凋亡過程等;KEGG信號通路共120條，主要涉及癌癥途徑、MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路等。結(jié)論：淫羊藿的活性成分通過作用于AKT1、TP53、IL6、VEGFA等靶點(diǎn)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程，調(diào)控癌癥途徑、TNF信號通路等多個途徑發(fā)揮增強(qiáng)免疫功能的作用。

關(guān)鍵詞 淫羊藿;免疫功能;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制;成分;靶點(diǎn);富集分析;信號通路

Study on the Mechanism of Herba Epimedii Enhancing Immune Function Based on Network Pharmacology

LIANG Biao，GAO Jiazhi，XU Zhaohui，WANG Jiandong，SHI Zhan

（Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Herba Epimedii to enhance immune function based on network pharmacology.Methods：The components and targets of Herba Epimedii were obtained by searching for Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform.Cytoscape 3.7.1 was used to build a network among drug，components and targets（drug-component-target network）.Targets for immunosuppression were screened through GeneCards.Protein interaction network analysis was performed by using the STRING database.Gene ontology analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes signal pathway enrichment analysis were performed by using the DAVID platform.Results：A total of 21 active ingredients and 179 potential targets of Herba Epimedii were screened.There were 562 GO biological process，including signal transduction，inflammatory response，apoptotic process，etc.There were 120 KEGG signaling pathways，including Pathways in cancer，MAPK signaling pathway，PI3K-AKT signaling pathway，TNF signaling pathway.Conclusion：The active ingredients of Herba Epimedii play a role in enhancing immune function by acting on AKT1，TP53，IL6，VEGFA and other targets，participating in biological processes such as signal transduction，regulating cancer pathways，TNF signaling pathways and other pathways.

Keywords Herba Epimedii; Immune function; Network pharmacology; Mechanism; Components; Target; Enrichment analysis; Signaling pathway

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.011

淫羊藿又名仙靈脾，是臨床常用補(bǔ)益類中藥，根據(jù)《中華人民共和國藥典》記載，淫羊藿具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“味辛寒。主陰痿絕傷，莖中痛，利小便，益氣力，強(qiáng)志……”并將其列為中品。研究表明，淫羊藿可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，對免疫器官、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等均具有一定的影響[1]。目前關(guān)于中藥及復(fù)方研究方法往往具有一定的局限性，難以更加全面地闡述其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探討淫羊藿增強(qiáng)免疫功能的潛在作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，以期為臨床應(yīng)用和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿活性成分和靶點(diǎn)的收集

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺[2]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）中，檢索淫羊藿的活性成分及活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，時間截止至2020年11月20日。設(shè)置口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18[3]作為篩選條件獲得淫羊藿的活性成分，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫[4]（https：//www.uniprot.org）將淫羊藿的靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將篩選得到的淫羊藿的活性成分和靶點(diǎn)整理成Excel文件，導(dǎo)入CytoScape3.7.1軟件[5]，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，通過分析相關(guān)參數(shù)，對淫羊藿關(guān)鍵活性成分進(jìn)行篩選。

1.3 免疫抑制相關(guān)靶點(diǎn)的收集及共同靶點(diǎn)的獲取? 在GeneCards數(shù)據(jù)庫[6]（https：//www.genecards.org/）中，以“immunosuppression”為檢索詞進(jìn)行檢索并篩選，得到免疫抑制相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。在Venny2.1.0在線作圖平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲取淫羊藿與免疫抑制的共同靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將藥物與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[7]（https：//string-db.org/），選擇“multiple proteins”“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)Degree值大小篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫[8-9]（https：//david.ncifcrf.gov/）能夠?qū)o定基因或蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義進(jìn)行系統(tǒng)分析，將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，進(jìn)行GO分析時選擇BP模塊，KEGG分析選擇PATHWAY模塊。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿活性成分和靶點(diǎn)的收集

檢索到淫羊藿130個活性成分，經(jīng)過OB和DL參數(shù)初步篩選后共獲得23個活性成分，剔除2個（MOL004394、MOL004425）未查詢到靶點(diǎn)的活性成分，最終獲得21個活性成分。見表1。檢索得到對應(yīng)的511個靶點(diǎn)蛋白，獲取179個靶點(diǎn)基因。

2.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將篩選得到的淫羊藿21個活性成分、179個靶點(diǎn)基因，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。網(wǎng)絡(luò)圖中“節(jié)點(diǎn)”（Node）代表屬性類型，如化合物、靶點(diǎn)、藥物、疾病等，“邊”（Edge）代表交互關(guān)系，連接度（Degree值）越大，代表其重要性越大。網(wǎng)絡(luò)圖中共包括201個節(jié)點(diǎn)，405條邊。圖中紅色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，綠色節(jié)點(diǎn)代表藥物，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)基因。

網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可知，槲皮素、木犀草素等6種活性成分能與24個以上靶點(diǎn)連接，可認(rèn)為這6種活性成分是淫羊藿的主要活性成分。見表2。

2.3 免疫抑制相關(guān)靶點(diǎn)的收集及共同靶點(diǎn)的獲取? 在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索免疫抑制的相關(guān)靶點(diǎn)，共檢索到3 627個相關(guān)靶點(diǎn)，將篩選出來的179個藥物靶點(diǎn)與3 627個疾病靶點(diǎn)在Venny2.1.0在線作圖平臺取交集得到138個共同靶點(diǎn)。見圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將篩選得到的138個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，置信度設(shè)置為>0.4，并剔除游離靶點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。再將STRING數(shù)據(jù)庫中獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytoScape3.7.1軟件，進(jìn)一步調(diào)整得到PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖4。每個節(jié)點(diǎn)（Node）代表1個靶點(diǎn)，邊（Edge）代表靶點(diǎn)之間存在相互作用關(guān)系。根據(jù)Degree值的大小設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小;Combined score值越大，邊線顏色越粗且越深。研究結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有137個節(jié)點(diǎn)，2 573條邊，平均度值為37.5，大于平均度值的靶點(diǎn)有57個。見表3。Degree值排名前10位的靶點(diǎn)為AKT1、TP53、IL6、VEGFA、JUN、TNF、CASP3、MAPK1、MYC、EGFR，可認(rèn)為這些靶點(diǎn)是淫羊藿增強(qiáng)免疫功能的潛在核心靶點(diǎn)。

2.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

GO富集分析共有562條結(jié)果，KEGG富集分析有120條信號通路。圖5展示顯著程度前20的GO生物功能富集結(jié)果。橫軸代表該通路基因占所有基因的比率（Ratio），縱軸代表GO生物過程信息條目。氣泡顏色由紅到綠代表P值由小變大，P值越大代表顯著性越強(qiáng)。氣泡越大代表該通路的基因個數(shù)（Count值）越多。由圖5可知，涉及的主要GO生物過程有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal Transduction）、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控，DNA模板（Positive Regulation of Transcription，DNA-templated）、凋亡過程的負(fù)調(diào)控（Negative Regulation of Apoptotic Process）、轉(zhuǎn)錄，DNA模板（Transcription，DNA-templated）、炎癥反應(yīng)（Inflammatory Response）、對藥物的反應(yīng)（Response to Drug）、基因表達(dá)的正調(diào)控（Positive Regulation of Gene Expression）、積極調(diào)控細(xì)胞增殖（Positive Regulation of Cell Proliferation）、凋亡過程（Apoptotic Process）等，表明淫羊藿可通過參與多個生物過程，從而發(fā)揮增強(qiáng)免疫功能的作用。KEGG通路富集分析結(jié)果見圖6，主要包括癌癥途徑（Pathways in Cancer）、TNF信號通路（TNF Signaling Pathway）、PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、MAPK信號通路（MAPK Signaling Pathway）、Proteoglycans in cancer、HTLV-I infection、Influenza A、MicroRNAs in cancer等。

2.6 “基因-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)KEGG分析結(jié)果，將較顯著的信號通路與對應(yīng)的靶點(diǎn)基因構(gòu)建“基因-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖7。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有20條信號通路，95個靶點(diǎn)基因，471條相互作用關(guān)系。Degree值>10的靶點(diǎn)有AKT1、RELA、MAPK1、IKBKB、CHUK、RAF1、MAPK8、TNF、NFKBIA、IL6、TP53等，這些靶點(diǎn)可能是淫羊藿增強(qiáng)免疫功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

3 討論

免疫功能主要是由機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，構(gòu)成免疫系統(tǒng)的重要組成部分主要由免疫器官（骨髓、脾臟、胸腺等）、免疫細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等）、免疫活性物質(zhì)（抗體、免疫球蛋白、腫瘤壞死因子等）組成，免疫系統(tǒng)是防御病原體入侵最有效的系統(tǒng)，它能夠識別和清除外來病原微生物，并識別和清除體內(nèi)突變的衰老細(xì)胞、死亡細(xì)胞及其他有害成分，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。相關(guān)研究表明，某些含多糖類、黃酮類、生物堿類等成分的中藥對免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，其主要藥理作用之一是促進(jìn)淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、造血干細(xì)胞的生理功能，從而增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫功能[10-12]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為補(bǔ)益類中藥能夠增強(qiáng)人體的抵抗力，現(xiàn)代研究證實(shí)淫羊藿的有效活性成分對機(jī)體主要的免疫器官胸腺和脾臟具有重要的調(diào)節(jié)作用，通過巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞影響特異性和非特異性免疫，通過IL-2、IL-3、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，此外，淫羊藿對內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等都具有較強(qiáng)的生物學(xué)作用[13-14]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，在TCMSP中共篩選出淫羊藿21種活性成分，在Uniprot數(shù)據(jù)庫中獲取179個相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并構(gòu)建了“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果表明，淫羊藿的有效活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、C-高赤霉素，1，6-二氫-3，15，16-三甲氧基-，（3β）-、脫水角蛋白、8-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮等。相關(guān)研究表明這些成分都具有抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等作用[15-18]。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到3 627個免疫抑制相關(guān)靶點(diǎn)，通過與藥物靶點(diǎn)取交集得到138個潛在靶點(diǎn)。對PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步分析可知，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系共有2 573種，AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、JUN、TNF、CASP3、MAPK1、MYC、EGFR等是淫羊藿增強(qiáng)免疫功能的主要作用靶點(diǎn)。AKT1是稱為AKT激酶的3種緊密相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，它調(diào)節(jié)許多過程，包括代謝、增殖、血管生成等[19-20]。腫瘤壞死因子（TNF）是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中對蛋白質(zhì)的信號傳遞起著至關(guān)重要的作用，可參與多種生理活動，組織免疫細(xì)胞之間進(jìn)行信息交流[21]。IL-6是由間質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有多效性的細(xì)胞因子，通過刺激抗體的產(chǎn)生和效應(yīng)T細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)而對獲得性免疫應(yīng)答起到重要的作用[22-23]。

GO富集分析結(jié)果表明，淫羊藿可參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、細(xì)胞增殖正調(diào)控、凋亡過程等多個生物過程，從而發(fā)揮增強(qiáng)免疫功能的作用。KEGG富集分析結(jié)果顯示，淫羊藿增強(qiáng)免疫功能涉及的主要通路有癌癥途徑、PI3K/AKT信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等。PI3K屬于磷脂激酶家族，機(jī)體內(nèi)多種因子均能激活PI3K，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。研究表明淫羊藿的活性成分淫羊藿苷可通過影響PI3K/AKT信號通路激活抑制A549細(xì)胞成活和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)對凋亡的抑制作用[25]。因此，淫羊藿的有效活性成分可通過參與多個生物過程，調(diào)控多個信號通路，進(jìn)而發(fā)揮增強(qiáng)免疫功能的作用。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究淫羊藿增強(qiáng)免疫功能的潛在作用機(jī)制，總結(jié)出淫羊藿增強(qiáng)免疫功能可能的主要靶點(diǎn)及信號通路，也體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為淫羊藿的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的理論依據(jù)。

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（2020-12-15收稿 責(zé)任編輯：馬雪玲，徐穎）