葡萄密度對所釀酒酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響研究

許凌凌，夏夢秋

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學院 生物工程學院，安徽 蕪湖 241002；2.蕪湖市生命健康工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241000)

巨峰葡萄(Kyoho grape)原產(chǎn)于日本，20世紀60年代引入我國并大規(guī)模推廣種植[1]。因其價格較低、口感較好，已成為我國當前葡萄栽培的主要品種之一[2]。巨峰葡萄果實酸甜可口，果形較大，柔軟多汁，其釀造的葡萄酒具有豐富的維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，且具有較高的食用價值[3]。葡萄酒以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部發(fā)酵或部分發(fā)酵制成含有一定酒精度的發(fā)酵酒[4]。我國葡萄酒的消費量偏低，人均年消費量遠遠低于世界人均水平，但是我國葡萄酒消費需求在逐年增長，葡萄酒產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。在我國釀酒葡萄品種中，赤霞珠占80%[5]，其余為美樂等品種，這造成了我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)同質(zhì)化現(xiàn)象。為解決這一問題，迎合消費者對不同風味葡萄酒的消費需求，釀造出風味不同的葡萄酒已成發(fā)展趨勢。

在同一個果園或者同一棵植物中，成熟過程中農(nóng)產(chǎn)品的異質(zhì)性幾乎是普遍存在的[6]，一般來說，土壤條件、氣候、品種、水分、施肥、收獲日期及田間管理等農(nóng)業(yè)生態(tài)因素影響著水果的成熟度[7]。Caccavello等[8]研究結(jié)果表明成熟期內(nèi)葡萄存在明顯的異質(zhì)性，成熟期葡萄密度對其理化性質(zhì)及營養(yǎng)品質(zhì)影響顯著，高密度葡萄成熟度較高，品質(zhì)較好。王軍等[9]對無核白葡萄的研究結(jié)果也得到了相同的結(jié)論。此外，在不同成熟度葡萄中，芳香成分、色澤和質(zhì)地的變化也得到了廣泛研究[10]。葡萄的成熟度不僅會影響原料的理化性質(zhì)，還會影響后續(xù)加工產(chǎn)品質(zhì)量，果實異質(zhì)性對后續(xù)深加工存在顯著影響[11]。

酚類物質(zhì)影響葡萄和葡萄酒的顏色和苦澀感，是評價葡萄和葡萄酒質(zhì)量的重要指標。同時酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、抗癌等特性，對于人體具有較高的保健功效[12-13]。葡萄及葡萄酒中富含豐富的酚類物質(zhì)，其含量主要與品種、栽培方式、氣候、植株整形方式有關(guān)。關(guān)于果實密度對其葡萄酒酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性變化的影響研究較少，且葡萄酒的營養(yǎng)價值主要來源其多酚類物質(zhì)及與其貢獻的抗氧化能力，因此采用合理方法對采收期葡萄進行分級，并對分級后葡萄所釀酒的酚類物質(zhì)及抗氧化能力進行分析，對葡萄酒品質(zhì)控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以市售成熟巨峰葡萄(果皮全紫)為實驗材料；所需試劑及生產(chǎn)廠家所需試劑及生產(chǎn)廠家如下所示。Lafazym Arom果膠酶、帝伯仕18度酵母，煙臺良緣酒業(yè)有限公司；偏重亞硫酸鈉、乙醇、磷酸、磷酸二氫銨、福林酚，天津市博迪化工有限公司。

標準品：兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、香草酸、水楊酸、龍膽酸、反式白藜蘆醇，上海一基生物試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、Trolox、福林酚試劑均購買自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD400-3型電子分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；1525型二元高壓液相色譜儀，美國Waters公司；UV-1600型紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海安亭生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葡萄成熟度分級

如表1所示，利用葡萄在氯化鈉溶液中的密度浮沉進行成熟度分級[9]，葡萄去梗后清水洗凈，將洗凈晾干的葡萄放置于配好的鹽水溶液中，根據(jù)不同成熟度葡萄的特性(密度高的沉下去，密度低的浮起來)進行分級。不同成熟度葡萄在鹽水中的密度分級如表1所示(相鄰密度的葡萄歸前一密度階段所有，例如：對應(yīng)密度為1078kg/m3的葡萄歸為S1成熟階段，以此類推)。

表1 葡萄按不同密度進行分級標準

1.3.2 釀造工藝

葡萄酒的釀造工藝參考周書來等[14]人的方法：將分級完成的葡萄清水洗凈并晾干后破碎，調(diào)整糖度為20°Bx，pH值為4.0，然后加入0.02%的亞硫酸鈉，按體積分數(shù)5%接種擴大培養(yǎng)的酵母菌，25℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵6d后補加釀酒酵母培養(yǎng)液和蔗糖，使用干凈紗布蓋住罐口并早晚壓帽一次，定時測量比重及溫度，比重降至1時進行皮渣分離，繼續(xù)發(fā)酵至比重為0.995左右，穩(wěn)定后加入60mg/L的SO2終止發(fā)酵，滿罐密封15d，陳釀120d(不同成熟度葡萄發(fā)酵時間略有差異，后續(xù)滿罐密封及陳釀時間從加入SO2后計)。

1.3.3 葡萄及葡萄酒中基本理化指標的測定

葡萄及葡萄酒中可溶性固性物、總酸、pH、酒精度的測定參考王沙沙[15]等人的方法。

1.3.4 總酚、總黃酮、總黃烷醇、總花色苷含量測定

以沒食子酸為當量，福林酚法測定葡萄酒中總酚的含量[16]；以槲皮素為當量，三氯化鋁法測定葡萄酒中總黃酮含量[17]；以兒茶素為當量，對二甲氨基肉桂醛(4-Dimethylaminocinnamaldehyde,P-DMACA)法測定葡萄酒中總黃烷-3-醇含量[17]；以矢車菊素-3-葡萄糖苷為當量，采用pH示差法測定葡萄酒中總花色苷含量[18]。

1.3.5 葡萄酒中單體酚類物質(zhì)含量測定

取葡萄酒30mL，加入60mL乙酸乙酯進行萃取，重復(fù)三次，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇溶解后定容至10mL容量瓶中待測。對照品溶液的制備：準確稱取15種對照樣品適量溶于甲醇中，分別配制濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.12mg/mL的單標標準品，15種對照品混標的濃度皆為0.05mg/mL，測定前樣品與標準品過0.22μm濾膜。

利用高效液相色譜法測定葡萄酒中的單體酚類物質(zhì)的含量。色譜柱：Waters XBridgeTM Shield RP18(4.6×250mm，3.5μm)，流動相A：乙腈-冰醋酸(98:2，V/V)，流動相B：水-冰醋酸(98:2，V/V)。流速為0.8mL/min，進樣量為20μL，柱溫箱為30℃，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.3.6 葡萄酒抗氧化能力測定

采用自由基清除法(DPPH)及鐵離子還原法(FRAP)對葡萄酒的抗氧化能力進行測定[18]，DPPH自由基清除能力的測定使用Trolox作為標準對照品，結(jié)果以mM TE/L表示，F(xiàn)RAP鐵還原能力的測定使用維生素C作為標準對照品，結(jié)果以mM AAE/L表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄及葡萄酒基本理化指標

相關(guān)研究表明：幾乎所有的葡萄在成熟過程中其可溶性固形物含量不斷升高、總酸含量降低[19-20]。由表3可知不同密度分級巨峰葡萄的可溶性固形物含量隨著成熟度的提高而不斷提高，其總酸含量隨著成熟度的提高而不斷降低，這也直接證明了密度分級法區(qū)分巨峰葡萄成熟度的可行性。不同成熟度巨峰葡萄發(fā)酵前后基本理化指標如表3所示，其各指標測定結(jié)果均符合國標GB/T15037-2006對干紅葡萄酒的質(zhì)量要求，巨峰葡萄發(fā)酵后其總糖含量均低于4g/L，其酒精含量均高于12%，其總酸含量為6.2～6.5g/L，各指標符合干紅葡萄酒的基本要求，滿足后續(xù)指標測定要求。

表3 不同成熟度葡萄及所釀葡萄酒基本理化指標分析

2.2 葡萄酒中總酚、總黃酮、總黃烷醇、總花色苷含量

酚類物質(zhì)是葡萄酒中重要的功能活性物質(zhì)，不僅影響著葡萄酒的感官品質(zhì)，而且具有抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等功效，對人體有著重要的生理功能[21]，因此測定不同成熟度葡萄所釀葡萄酒中酚類物質(zhì)的含量至關(guān)重要。隨著葡萄成熟度的提高，葡萄酒中總酚含量顯著升高，具有顯著性差異(p<0.05)，這也與前人的研究結(jié)果一致[22]。如表4所示，不同成熟度葡萄所釀葡萄酒中總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷含量變化趨勢與總酚含量一致，總黃酮含量變化范圍為1155.4mg/L到1442.1mg/L；總黃烷-3-醇含量變化范圍為445.5mg/L到662.3mg/L；總花色苷含量范圍為54.1mg/L到98.2mg/L。

表4 不同成熟階段葡萄酒總酚、總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷含量(mg/L)

2.2.1 葡萄酒中黃烷-3-醇物質(zhì)含量

不同成熟度的巨峰葡萄所釀葡萄酒的四種黃烷-3-醇含量如表5所示，兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯含量最高，是五個不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒中最主要的黃烷-3-醇類物質(zhì)，高含量的黃烷-3-醇類物質(zhì)來源于發(fā)酵過程中皮籽的浸漬[17]。葡萄酒中表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量隨著葡萄成熟度的提高而不斷降低，在S4、S5成熟階段的巨峰葡萄所釀葡萄酒中未檢測到表沒食子兒茶素沒食子酸酯，隨著葡萄成熟度的提高，葡萄酒中兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯與其他兩種黃烷-3-醇類變化趨勢不同，呈現(xiàn)升高趨勢，可能的原因為巨峰葡萄成熟過程中不同酚類物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化。

表5 不同成熟度巨峰葡萄所釀葡萄酒中黃烷-3-醇含量(mg/L)

2.2.2 葡萄酒中黃酮醇及芪類物質(zhì)含量

黃酮醇是類黃酮的一大組分，葡萄果皮中的黃酮醇通過發(fā)酵轉(zhuǎn)移到葡萄酒中，并對葡萄酒的苦味和顏色有所貢獻[23]，不同成熟階段巨峰葡萄所釀酒中兩種黃酮醇(蘆丁，槲皮素)含量變化如表6所示，蘆丁為巨峰葡萄酒中最主要的黃酮醇，其含量范圍為1.4～3.8mg/L，且其含量隨著成熟度的提高呈現(xiàn)升高趨勢；在S1，S2成熟階段，葡萄酒中未檢測到槲皮素，槲皮素含量在S5成熟期達到最高為0.5mg/L。葡萄酒中反式白藜蘆醇是其最重要的芪類物質(zhì)，品種、氣候條件、發(fā)酵過程都會對其含量造成顯著影響，由表6結(jié)果所示不同成熟階段葡萄所釀酒中反式白藜蘆醇含量范圍為0.5～2.7mg/L，這與其他相關(guān)文獻報道含量一致[24]，且隨著葡萄成熟度的提高其酒中含量不斷升高。

表6 不同成熟階段葡萄酒中黃酮醇及芪類物質(zhì)含量(mg/L)

2.2.3 葡萄酒中對羥基苯甲酸物質(zhì)含量

不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒中對羥基苯甲酸物質(zhì)含量變化如表7所示，巨峰葡萄酒中四種對羥基苯甲酸物質(zhì)中沒食子酸含量最高，是主要的對羥基苯甲酸物質(zhì)，這也與Fanzone等[25]報道歐亞葡萄品種中沒食子酸是最要的單體酚類結(jié)果相符，其在葡萄酒中的含量隨著葡萄成熟度的提高而呈現(xiàn)上升趨勢，這也與總酚含量呈現(xiàn)上升趨勢吻合，巨峰葡萄酒中龍膽酸含量變化趨勢與沒食子酸一致；巨峰葡萄酒中香草酸含量與沒食子酸、龍膽酸含量變化趨勢相反，隨著巨峰葡萄成熟度的提高其所釀酒中香草酸含量不斷降低，葡萄S1成熟期香草酸含量最高達到了2.7mg/L，S5成熟期香草酸含量最低為1.2mg/L；S1、S2葡萄成熟期葡萄酒中未檢測到水楊酸，且隨著葡萄成熟度提高其葡萄酒中水楊酸含量變化不明顯。

表7 不同成熟階段葡萄酒中對羥基苯甲酸物質(zhì)含量(mg/L)

2.2.4 葡萄酒中對羥基肉桂酸物質(zhì)含量

不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒中對羥基肉桂酸物質(zhì)含量變化如表8所示，其中綠原酸與咖啡酸含量最高，是巨峰葡萄酒中主要的對羥基肉桂酸類物質(zhì)，綠原酸含量范圍為8.5～12.4mg/L；咖啡酸含量范圍為6.2～9.3mg/L，且隨著葡萄成熟度的提高，葡萄酒中兩種酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)升高趨勢，而其他兩種酚類物質(zhì)(對香豆酸、阿魏酸)變化趨勢與之相反。

表8 不同成熟階段葡萄酒中對羥基肉桂酸物質(zhì)含量(mg/L)

2.3 不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒抗氧化活性的變化

不同成熟期葡萄所釀葡萄酒抗氧化能力如表9所示，為直觀分析不同成熟度葡萄對其所釀葡萄酒抗氧化能力的影響，以DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力評價葡萄酒抗氧化能力，兩種評價方式廣泛應(yīng)用于葡萄酒的抗氧化能力評價。相關(guān)報道表明葡萄酒中酚類物質(zhì)含量與其抗氧化能力顯著相關(guān)[26-27]，由表9結(jié)果顯示不同成熟度巨峰葡萄所釀葡萄酒皆顯示出較強的抗氧化能力且抗氧化活性差異顯著，不同成熟階段葡萄酒的DPPH自由基清除能力值為1.15～1.54mM TE/L；鐵離子還原能力為663.2～991.3mM AAE/L，低于相關(guān)文獻報告的美樂、赤霞珠和康貝爾所釀葡萄酒的抗氧化能力[28]，原因為葡萄品種不同其抗氧化能力存在顯著差異。隨著巨峰葡萄成熟度的提高，無論是DPPH清除自由基能力還是鐵離子還原能力皆顯示升高趨勢，這也與總酚含量變化趨勢一致，S5成熟期巨峰葡萄所釀葡萄酒抗氧化能力最強，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的主要原因可能是葡萄成熟度越高其抗氧化能力越強，諸多對于水果品質(zhì)的相關(guān)研究也證實了這一點[13,29-30]。

表9 不同成熟階段葡萄酒抗氧化活性

3 結(jié)論

研究以成熟巨峰葡萄(果皮全紫)為材料，將其置于不同濃度氯化鈉溶液中并根據(jù)其密度不同進行分級，將分級后巨峰葡萄進行發(fā)酵，探究不同成熟度葡萄所釀葡萄酒其總酚、總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷、單體酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的差異，經(jīng)比較分析得知：隨著葡萄果實密度的提高，所釀葡萄酒中總酚、總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷含量呈上升趨勢，總酚含量的變化范圍為1624.4～1927.5mg/L，總黃酮含量的變化范圍為1155.4～1442.1mg/L，總黃烷-3-醇含量變化范圍為445.5～662.3mg/L，總花色苷含量變化范圍為54.1～98.2mg/L。不同密度巨峰葡萄所釀酒中共檢測出15種單體酚類物質(zhì)(4種黃烷-3-醇，2種黃酮醇，4種對羥基苯甲酸，4種對羥基肉桂酸，1種芪類)，其中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素含量最高是其最主要的酚類物質(zhì)。

不同密度的巨峰葡萄所釀葡萄酒皆顯示出較高的抗氧化能力，且隨著葡萄密度的提高其抗氧化能力提高，S5成熟期葡萄所釀葡萄酒的DPPH自由基清除能力、總還原力最強(DPPH自由基清除能力為1.54mM TE/L，總還原力為991.3mM AAE/L)，因此選擇高密度的巨峰葡萄作為釀酒原材料較為合適。