菊科類(lèi)青蒿同源四倍體的誘導(dǎo)和根尖染色體鑒定研究

張 宇

(亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800)

青蒿為菊科艾屬一年生草本植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有清熱解暑、除蒸、截瘧和抗菌之功效[1-2]，主要是其體內(nèi)含有大量的倍半萜內(nèi)酯活性成分。其中從青蒿植株中提取的青蒿素是市場(chǎng)上供不應(yīng)求的抗瘧消炎藥物，長(zhǎng)期以來(lái)均是依賴(lài)于采集野生青蒿進(jìn)行提取[3]。但是由于生長(zhǎng)環(huán)境和青蒿自身的原因?qū)е?，野生青蒿的分布比較稀疏，植株內(nèi)的青蒿素含量較低，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)階段市場(chǎng)的需求[4]。此外，由于不規(guī)范的采摘導(dǎo)致野生青蒿越來(lái)越稀少，特別是花期前采收導(dǎo)致野生青蒿沒(méi)有種子傳播，嚴(yán)重阻礙了野生青蒿的種子繁殖途徑[5]。因此，急需通過(guò)生物、化學(xué)的手段不斷擴(kuò)大野生青蒿的繁育途徑，培育高質(zhì)量人工繁育植株。為解決這一難題，滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)青蒿素的生產(chǎn)進(jìn)行了大量研究，如：細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[6]、種源篩選[7]和R質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的青蒿發(fā)根培養(yǎng)[8]，化學(xué)全合成生產(chǎn)青蒿素等[9]。但是，目前有關(guān)青蒿育種方面的研究報(bào)道甚少，而且已有研究也只是利用化學(xué)方法誘導(dǎo)了多倍體，很少有對(duì)所得的變異株系做進(jìn)一步的性狀鑒定和化學(xué)含量方面的測(cè)定[10-11]。多年來(lái)，人工誘導(dǎo)多倍體的研究一直吸引著廣大植物育種工作者，尤其是多倍體植株具有產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)和生長(zhǎng)活性大等特點(diǎn)。本文以秋水仙堿為誘變劑，考察在不同誘變時(shí)間(12h、24h、36h和48h)、誘變濃度(0.2%、0.1%、0.05%)條件下青蒿種子的存活率與誘變。同時(shí)，通過(guò)比較誘變育苗與未誘變育苗的性狀，篩選具有優(yōu)良性狀的品種，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的青蒿優(yōu)良品種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

自培育的青蒿(ArtemisiaannuaL.)無(wú)菌苗；秋水仙堿為由北京化工廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?；二甲基亞砜、萘乙?NAA)、MS培養(yǎng)基和吲哚乙酸(IAA)均生物級(jí)試劑，由上海吉至生化科技有限公司提供；丙草胺、鹽酸和苯酚為分析純，由上海麥克林生化科技有限公司提供；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌苗誘導(dǎo)處理

取生長(zhǎng)20d的青蒿無(wú)菌苗作為供試材料。切取青蒿試管苗幼芽，用含2%二甲基亞砜(DMSO)及丙草胺(表面活性劑)的不同濃度秋水仙堿溶液(二甲基亞砜，丙草胺及秋水仙堿溶液三者的體積比例為10:1:2000，無(wú)菌秋水仙堿濃度梯度：0.2%、0.1%、0.05%)[5]浸泡不同時(shí)間(12h，24h，36h和48h)，將處理后仍成活的苗建立株系，以無(wú)菌水清洗后轉(zhuǎn)入到最佳繁殖培養(yǎng)基，即MS+6-BA 0.5mg/L+IAA0.1mg/L[6]中擴(kuò)大繁殖，培養(yǎng)20d后將仍存活的芽建立株系并擴(kuò)繁，并對(duì)芽存活率以及誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 根尖染色體鑒定

將培養(yǎng)20d的青蒿試管苗，切取帶2-3個(gè)腋芽的莖段接種在1/2MS+NAA1.0mg/L培養(yǎng)基[5]上誘導(dǎo)生根，待根長(zhǎng)至0.2～0.5cm時(shí)，切取青蒿根尖，蒸餾水洗三次，隨機(jī)分組，分別以不同濃度秋水仙堿溶液在10～20℃下預(yù)處理不同時(shí)間，水洗三次，以清除秋水仙堿殘留物，放置冰箱中固定24h，60℃下0.2M HCl水解不同時(shí)間，蒸餾水清洗，用改良苯酚品紅染色，壓片，鏡檢[12]，并統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率(誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)數(shù)/處理芽數(shù))。為了進(jìn)一步提高染色體的鑒定效果和速度，按表1參數(shù)進(jìn)行研究，得到最佳的染色體鑒定方法。

表1 根尖染色體鑒別實(shí)驗(yàn)參數(shù)

1.2.3 青蒿二倍體與四倍體比較分析

(1)氣孔開(kāi)度

隨機(jī)選取生長(zhǎng)2個(gè)月的青蒿各株系(包括對(duì)照組，即二倍體株系)，挑取其全展葉片，制作成臨時(shí)裝片，在顯微鏡下觀察并計(jì)量，每個(gè)株系觀察15個(gè)視野，隨機(jī)挑取5個(gè)視野，記錄氣孔的長(zhǎng)和寬，比較青蒿二倍體植株與四倍體植株的氣孔開(kāi)度大小。

(2)試管苗形態(tài)

對(duì)生長(zhǎng)2個(gè)月的各株系進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較，比較項(xiàng)目包括①株高：主莖基部至頂梢的總長(zhǎng)；②葉面積：葉長(zhǎng)×葉寬；③莖粗：測(cè)定植株中部主莖的直徑。其中，測(cè)量葉面積時(shí)，要挑選各植株相同部位的葉片，本實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)一選取植株中部的葉片。各個(gè)株系都隨機(jī)選取10株試管苗，求取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿多倍體誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)中，多倍體誘導(dǎo)克服了自然狀態(tài)下青蒿素普遍含量低，且不穩(wěn)定，受地理環(huán)境采集時(shí)期、采集部位、氣溫和施肥等因素的影響，品質(zhì)不易控制等因素的限制，可以培育出含量高且穩(wěn)定的新品種，可以提高青蒿素含量及加快繁育周期。秋水仙堿溶液誘導(dǎo)青蒿同源四倍體的方法及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度秋水仙堿浸泡不同時(shí)間對(duì)青蒿多倍體誘導(dǎo)的影響

如表2所示，秋水仙堿對(duì)青蒿苗的誘導(dǎo)效果和濃度、浸泡時(shí)間有直接關(guān)系：當(dāng)秋水仙堿濃度小于0.1%且浸泡時(shí)間小于24h時(shí)，青蒿苗的存活性呈正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)秋水仙堿濃度大于0.1%和浸泡時(shí)間大于24h時(shí)，青蒿苗的存活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)秋水仙堿濃度為0.2%、浸泡時(shí)間24h時(shí)，青蒿苗誘導(dǎo)率最大達(dá)36%，成活率為36%，因此該條件為青蒿試管苗的最佳誘導(dǎo)條件。

2.2 青蒿根尖染色體鑒定結(jié)果

植株細(xì)胞染色體的倍數(shù)是表征遺傳變異育種的重要方法之一。通過(guò)用0.2%的秋水仙堿浸泡，更有利于使分裂細(xì)胞的染色體縮短、分散，從而便于觀察。而通過(guò)解離，使細(xì)胞之間的連接破壞，到后來(lái)壓蓋玻片的時(shí)候可以把細(xì)胞散開(kāi)，不至于一個(gè)摞一個(gè)看不清單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)與比較，最終確定用于青蒿根尖染色體鑒定的最佳流程為：早8點(diǎn)切取根尖，先用0.2%的秋水仙堿浸泡3h，再以卡諾氏固定液固定2h，解離后壓片鏡檢，共獲得8個(gè)多倍體株系，其中四倍體和二倍體試管苗根尖染色體結(jié)果如圖1所示。青蒿二倍體根尖染色體數(shù)目2n=18條，四倍體根尖染色數(shù)目2n=36條。

(a)二倍體(2n=2x=18)

(b)四倍體(2n=4x=36)

2.3 青蒿二倍體與四倍體植株氣孔比較

為了驗(yàn)證比較誘變植株和原植株的光合作用，進(jìn)行葉片氣孔的形態(tài)、大小等特征分析[6]。因?yàn)槿~片氣孔是連接外界環(huán)境的重要通道，承擔(dān)著水分和氣體的有效運(yùn)輸任務(wù)，與植株的抗逆性有著重要的相關(guān)性[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，以原二倍體植株作為對(duì)照組，記為CK。其余誘導(dǎo)得到的各株系分別記為A、B、C。將部分植株測(cè)量、處理后得出的數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。顯微鏡下觀察二倍體及四倍體試管苗氣孔差異，具體見(jiàn)圖2。

表3 青蒿部分二倍體與四倍體試管苗氣孔結(jié)果

(a)二倍體

(b)四倍體

通過(guò)表3可以明顯的發(fā)現(xiàn)，多倍體株系氣孔的長(zhǎng)度和寬度，明顯的大于對(duì)照組二倍體植株，結(jié)合圖2，我們也可以直觀的看到，青蒿四倍體植株的氣孔開(kāi)度大于二倍體植株。由表3可知，統(tǒng)計(jì)得到A1-2株系的氣孔平均長(zhǎng)度及平均寬度大約為對(duì)照組的2.90、4.19倍。由上，可推斷四倍體植株相對(duì)于二倍體植株，能更好的進(jìn)行水分和氣體的交換，更高效率的進(jìn)行光合作用，從而有利于育種。

2.4 青蒿二倍體與四倍體試管苗形態(tài)的比較

試管苗二倍體與四位體性狀比較圖如圖3所示。

將原二倍體植株作為對(duì)照組，記為CK。部分植株比較的具體數(shù)據(jù)，見(jiàn)表4。

表4 試管苗二倍體與四倍體性狀比較

二倍體植株生長(zhǎng)正常，而四倍體植株生長(zhǎng)緩慢。由表4可以明顯看出，多倍體植株在株高、葉面積以及莖粗方面相對(duì)于二倍體植株都發(fā)生了變化。結(jié)合圖3，看出二倍體植株葉片較薄，正常綠色，邊緣略向上翹，葉脈突起不明顯，節(jié)間較長(zhǎng)；而四倍體植株的葉片增厚，呈深綠色，邊緣略下卷，葉脈明顯突起，節(jié)間縮短，莖粗壯。誘導(dǎo)得到的青蒿四倍體在試管苗階段已經(jīng)表現(xiàn)出莖粗壯，葉片寬大等多倍體的巨型性特征，預(yù)示了其在田間生長(zhǎng)的趨勢(shì)。

3 結(jié)論

為構(gòu)建高產(chǎn)量?jī)?yōu)質(zhì)青蒿植株品種體系，本文采用化學(xué)誘導(dǎo)育種方法考察青蒿同源四倍體的誘導(dǎo)，為遺傳育種提供了選育優(yōu)良品種的一種方法。通過(guò)添加具有提高細(xì)胞壁的透性的二甲基亞砜和保持細(xì)胞表面濕潤(rùn)性的丙草胺混合溶液，促進(jìn)秋水仙堿進(jìn)入植物組織。青蒿試管苗的最佳誘導(dǎo)條件為：秋水仙堿濃度為0.2%、浸泡時(shí)間24h時(shí)，青蒿苗誘導(dǎo)率最大達(dá)36%，成活率為36%。根據(jù)根尖染色體進(jìn)行了鑒定結(jié)果顯示，多倍體植株在株高、葉面積以及莖粗方面相對(duì)于二倍體植株均具有明顯優(yōu)勢(shì)，鑒定出8個(gè)性狀優(yōu)良的四倍體株系為A1-1、A1-2、A2-10、A2-2、B4-1、B4-2、C1-1、C1-2。