高遷移率族蛋白B 1在三陰性乳腺癌中的表達及與臨床特征的關系研究

秦文華，楊寶軍，張芳，張明芳

平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院病理科，河南 平頂山 467000

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，具有高度的異質性，嚴重威脅女性身心健康。調查顯示，中國每年女性乳腺癌新增病例高達200萬例，占女性惡性腫瘤的1/4以上，且近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌均起源于乳腺導管上皮及腺上皮組織，但不同類型的乳腺癌預后存在明顯的異質性。隨著基因技術的發(fā)展，專家從分子表型對乳腺癌進行了分類，即Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過表達型、三陰性乳腺癌。雖然臨床上三陰性乳腺癌占比較小，約為15%，但其具有侵襲性強、發(fā)病早、復發(fā)率高、轉移率高、預后差的特點，而且沒有確定的分子靶點，給其治療帶來了一定的難度。因此，尋找新的分子靶點，對于改善三陰性乳腺癌的療效及預后具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）在乳腺癌中高表達，認為其可能與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲及轉移相關。因此，本研究探討HMGB1在三陰性乳腺癌中的表達及與患者臨床特征的關系，以期為尋找治療三陰性乳腺癌的新分子靶點提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2020年1月平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院收治的98例三陰性乳腺癌患者作為研究對象。納入標準：①經(jīng)病理組織學、細胞學、影像學等檢查確診為三陰性乳腺癌；②年齡18～80歲；③采取手術治療，且手術前未進行其他抗腫瘤治療；④臨床資料齊全，石蠟組織完整。排除標準：①合并重要器官功能障礙；②合并其他惡性腫瘤；③妊娠期或哺乳期女性。98例三陰性乳腺癌患者中，年齡≤50歲38例，﹥50歲60例；伴有淋巴結轉移55例，無淋巴結轉移43例；腫瘤直徑：≤35 mm 40例，﹥35 mm 58例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期56例；組織學分級：Ⅰ～Ⅱ級41例，Ⅲ級57例；絕經(jīng)61例，未絕經(jīng)37例；有脈管侵犯29例，無脈管侵犯69例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 三陰性乳腺癌診斷標準

根據(jù)免疫組織化學法檢測的雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、HER2的表達情況，三者均為陰性則確定為三陰性乳腺癌。ER、PR均定位于細胞核，以10%腫瘤細胞出現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性。HER2定位于細胞膜，根據(jù)細胞膜染色程度進行判定，0：無細胞膜染色；+：﹤10%的細胞膜弱染色，且呈間斷分布；++：10%～30%的細胞膜存在弱到強染色，且強性染色環(huán)繞整個細胞膜；+++：﹥30%的細胞膜呈強染色；染色程度0～+判定為陰性，++～+++判定為陽性。

1.3 檢測方法

收集患者腫瘤組織及癌旁正常組織石蠟塊進行組織切片，采用免疫組織化學法檢測組織中HMGB1的表達情況。具體過程如下：①將石蠟包埋的三陰性乳腺癌組織和癌旁正常組織用切片機連續(xù)切片，厚度約3 μm，將準備好的玻片涂抹上0.01%多聚賴氨酸，再將切片置在玻片上，60～62℃烤片3 h，之后放置在37℃的恒溫箱中保存，待第二天染色。②切片常規(guī)脫蠟，用純化水沖洗5 min，再用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3次，每次3 min。③抗原修復，將抗原修復液（Tris-EDTA）在95～100℃的水浴鍋中預熱，將切片浸泡在修復液中并預熱15 min，然后取出冷卻至室溫后，用PBS沖洗3次，每次3 min。之后將切片置于3%雙氧水（HO）中10 min，目的是阻斷內源性HO酶，再次用PBS沖洗3次。④滴加抗體孵育，配置工作濃度的第一抗體（Anti-HMGB1），室溫孵育2 h，PBS沖洗3次。一抗用PBS代替作為陰性對照。⑤加入二抗goat anti-rabbit IgG-HRP（ab6721），室溫孵育1 h，用PBS沖洗5次。⑥二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，將切片置入新鮮配置的DAB顯色液中染色2 min，用純化水沖洗2 min，加入蘇木素復染核2 min，用中性樹膠封片，待統(tǒng)一鏡檢。

1.4 結果判定

HMGB1陽性染色為細胞核或細胞質內有棕黃色或黃褐色顆粒，且定位明確、結構清晰。每張切片在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野，對陽性細胞染色程度及陽性細胞所占比例進行評分。染色程度：切片無染色或接近背景色計為0分，切片染色為淺黃色且略深于背景色計為1分，切片染色為棕黃色且明顯深于背景色計為2分，切片染色為深棕黃色計為3分。陽性細胞所占比例：無陽性細胞計為0分，陽性細胞所占比例﹤10%計為1分，10%～50%計為2分，51%～75%計為3分，﹥75%計為4分。根據(jù)切片染色程度評分和陽性細胞所占比例評分的乘積對結果予以判定：陰性（-）0～2分，弱陽性（+）3～4分，中度陽性（++）5～8分，強陽性（+++）9～12分；分數(shù)≥3分定義為陽性，分數(shù)﹤3分定義為陰性。結果由同一組具有高級職稱的醫(yī)師采用雙盲法閱片，意見不統(tǒng)一且協(xié)商不一致時，由上級醫(yī)師判定。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ檢驗，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HMGB 1表達情況的比較

HMGB1在三陰性乳腺癌組織中的陽性表達率為66.33%（65/98），明顯高于癌旁正常組織的27.55%（27/98），差異有統(tǒng)計學意義（χ=29.580，P﹤0.01）。

2.2 不同臨床特征的三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中HMGB 1表達情況的比較

有淋巴結轉移、組織學分級為Ⅲ級、Ki-67≥14%的三陰性乳腺癌患者的腫瘤組織中HMGB1陽性表達率分別高于無淋巴結轉移、組織學分級為Ⅰ～Ⅱ級、Ki-67﹤14%的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、臨床分期、月經(jīng)狀態(tài)及脈管侵犯情況的三陰性乳腺癌患者的腫瘤組織中HMGB1陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中HMGB 1表達情況的比較

3 討論

高遷移率族蛋白（high mobility group，HMG）是Goodwin等在1973年研究牛的胸腺時發(fā)現(xiàn)的一種細胞核蛋白，其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度高于其他蛋白，并因此命名。HMGA、HMGB、HMGN均屬于HMG家族成員，HMGB1是HMGB家族成員之一，其氨基酸序列高度保守，真核生物間的氨基酸序列同源性高達80%。而人的HMGB1基因位于13號染色體上，分子量為25 000 kD，由A盒、B盒、C末端3個結構域構成，不僅可與DNA結合，作為基因和轉錄調控因子參與細胞核內的多種生命活動，其分子還參與炎性反應及促進腫瘤細胞生長、增殖、分化等病理過程。正常情況下，HMGB1基因在細胞及組織中的表達被精確調控于一個基礎水平，當細胞或組織發(fā)生增殖、分化后，其表達有所上升，而在部分腫瘤細胞中高表達，尤其是肝癌、乳腺癌、結直腸癌及胃癌。

本研究結果顯示，三陰性乳腺癌組織中HMGB1陽性表達率明顯高于癌旁組織，提示HMGB1在三陰性乳腺癌組織中呈高表達。這與HMGB1的功能密切相關，研究顯示，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（the receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）是HMGB1對應的配體，可在乳腺癌中高表達；配體高表達會使得HMGB1表達上調，二者結合可觸發(fā)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、Racl/cdc42、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等多條信號通路，使細胞信號調控機制受到干擾，從而促進腫瘤細胞的生長及增殖，故HGMB1表達水平提高與腫瘤細胞增殖程度提升相關。

本研究結果顯示，HMGB1的表達與三陰性乳腺癌患者的淋巴結轉移情況、組織學分級及Ki-67表達有關，而與年齡、臨床分期、腫瘤直徑、月經(jīng)狀態(tài)、脈管侵犯情況無關。這與HMGB1以下幾個方面的作用有關：①HMGB1與其配體RAGE及其他受體如 Toll樣受體 2（toll-like receptor 2，TLR2）、Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）結合后，可激活NF-κB、MAPK等信號通路，使得基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）被活化，細胞外基質被降解，導致腫瘤細胞的浸潤和轉移更容易發(fā)生；②HMGB1激活NF-κB信號通路可促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達上調，從而促進腫瘤新生血管生成，使腫瘤細胞發(fā)生轉移；③HMGB1參與細胞骨架肌動蛋白調節(jié)進而促進細胞分裂和運動，提高腫瘤細胞遷移能力。Ki-67是細胞核增殖抗原，相關動物實驗發(fā)現(xiàn)Ki-67受到抑制后腫瘤生長也受到抑制，認為Ki-67與腫瘤的生長密切相關。進一步研究顯示，Ki-67在包括乳腺癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，可作為分子標志物評估患者的預后。本研究中，Ki-67高表達的三陰性乳腺癌患者HMGB1陽性表達率較高，Ki-67高表達提示腫瘤細胞增長旺盛、腫瘤病情進展加快、患者預后不良，故Ki-67高表達的三陰性乳腺癌患者多預后不良，這類患者HMGB1陽性表達率高提示三陰性乳腺癌患者預后不良可能與HMGB1過表達有關。有研究表明，直腸癌患者中HMGB1陽性表達者中位生存時間較陰性表達者短；下調HMGB1基因表達會抑制喉癌細胞增殖水平和侵襲力，側面提示HMGB1陽性表達會影響腫瘤患者預后，其表達水平與腫瘤增殖水平和侵襲力密切相關。

綜上所述，HMGB1在三陰性乳腺癌組織中高表達，且其陽性表達與淋巴結轉移、組織學分級、Ki-67表達有關，可作為治療三陰性乳腺癌的候選靶點。本研究尚存在不足之處，因為隨訪時間短不能分析HMGB1表達情況與患者預后的相關性，需進一步研究加以證實。