基于QuEChERS-GC-MS/MS法同時測定湘產黃精中的74種農藥殘留

馬杰，丁野，孫輝*，王湘波（1. 湖南省藥品檢驗研究院，長沙 410001；2. 湖南省藥品質量評價工程技術中心，長沙 410001）

黃精是百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 的干燥根莖，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效[1]，是藥食同源的多用途植物，為我國常用大宗中藥材品種。隨著國內外對黃精開發(fā)的熱度不斷升溫，特別是在營養(yǎng)保健、中國老年疾病預防等方面的需求增大，黃精的種植規(guī)模不斷擴大。在黃精的各種來源中，尤以湖南產的多花黃精品質為上乘[2-3]。為了防治病蟲害[4-5]，黃精藥材種植者往往憑借經驗用藥，種植過程中亂用、濫用、誤用農藥時有發(fā)生，導致質量安全隱患，從而制約了黃精產業(yè)的發(fā)展和升級。目前，黃精中的農藥多殘留檢測報道較少，缺乏較為系統(tǒng)、可靠的檢測方法。

QuEChERS 法是近年來中成藥中農藥多殘留成分較為常用的前處理方法之一[6-7]，具有快速（Quick）、簡單（Easy）、廉價（Cheap）、有效（Effective）、可靠（Rugged）及安全（Safe）的優(yōu)勢，其利用吸附劑填料與樣品基質中的雜質相互作用達到對供試品除雜凈化的目的，以實現(xiàn)雜質的最低限度干擾。氣相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用（GCMS/MS）技術靈敏度高、專屬性強，可一次完成對多種農藥殘留的痕量分析，目前已被廣泛應用于中藥材中農藥多殘留的測定。QuEChERS 聯(lián)合GC-MS/MS，成功解決了各種復雜基質中藥材中多種農藥殘留的檢測問題[8-9]。

為實現(xiàn)對黃精藥材中農藥殘留風險評價，本文建立了一種QuEChERS-GC-MS/MS 同時測定藥材中74 種農藥殘留量的方法，并測定了湖南省內收集的4 批次黃精樣品中的農藥殘留情況。

1 儀器與試藥

7890B/7010 型三重四級桿氣相色譜質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；AE240 型天平（德國梅特勒托利多公司）；EYELA CM-1000 高速震蕩儀（上海愛朗儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；SHIMSEN樣品前處理凈化鹽包（含無水硫酸鎂6.0 g 與無水乙酸鈉1.5 g），SHIMSEN 樣品前處理凈化材料[含無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化炭黑90 mg，日本島津公司]；冰醋酸為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水均為高純水（經Milli-Q 超純水器純化）；74 種農藥對照品溶液（批號：30765XT/30766XT/30767XT，質量濃度均為100 μg·mL－1，北京曼哈格生物科技有限公司）；氘代莠去津內標儲備液（ethylamino D5，批號：20441XB，100 μg·mL－1）。4 批樣品購自藥材市場及中藥飲片生產企業(yè)，產地均為湖南，經丁野主任中藥師鑒定為黃精Polygonatum sibiricum Red.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[10-12]

HP-5MS 彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣，恒壓模式，柱前壓為124 kPa；進樣口溫度為280℃，脈沖不分流進樣。程序升溫：初始溫度70℃，保持2 min，先以25 ℃·min－1升溫至140℃，再以4℃·min－1升溫至200 ℃，最后以7 ℃·min－1升溫至280℃，保持8 min。

2.2 質譜條件

EI 源，70 eV，離子源溫度為270℃，接口溫度為280℃。碰撞氣：氮氣（純度≥99.999%）；溶劑延遲：5 min；質譜監(jiān)測模式：MRM 模式分段；每種化合物選擇兩對離子對。保留時間、離子對、碰撞能等如表1 所示。

表1 74 種農藥的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞電壓(CE)Tab 1 Retention time，monitoring ion pairs and collision voltage of the 74 pesticides

續(xù)表1

2.3 溶液的配制

2.3.1 供試品溶液 將樣品置于－18℃冷凍48 h后，立即粉碎得黃精粉末。取黃精粉末（過二號篩）3 g，精密稱定，置于50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，加入超純水15 min，渦旋使充分浸潤，靜置30 min；精密加入1%醋酸乙腈（取冰醋酸溶液1 mL，加乙腈至1000 mL）15 mL 和內標溶液100 μL，渦旋震蕩5 min，冰浴冷卻5 min，加入前處理凈化鹽包（含無水硫酸鎂6.0 g 與無水乙酸鈉1.5 g），渦旋混合5 min，離心5 min（8000 r·min－1）；取上清液9 mL 置于含SHIMSEN 樣品前處理凈化材料的塑料離心管中，渦旋混合1 min，離心，精密吸取上清液5 mL 置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取對照品溶液，加含0.05%醋酸的乙腈配制成0.1 μg·mL－1和1 μg·mL－1的兩種混合對照品溶液。

2.3.3 內標溶液的制備 取氘代莠去津內標儲備液適量，加乙腈制成質量濃度為6 μg·mL－1的溶液。

2.3.4 空白基質的篩選 取黃精樣品，按照“2.3.1”項下方法制備，進樣分析，找出未檢出74 種目標農藥的空白基質樣品，最終確認樣品4為空白基質樣品。

2.3.5 基質混合對照品溶液的制備 取空白樣品3 g，共6 份，同“2.3.1”項下方法處理至“置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL”，分別加入混合對照品溶液（0.1 μg·mL－1）50、100 μL，混合對照品溶液（1 μg·mL－1）50、100、200、400 μL，加乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得基質混合對照品溶液，系列質量濃度分別為5、10、50、100、200、400 ng·mL－1。

精密吸取上述溶液各1 μL，進樣測定，按標準曲線法計算供試品中74 種農藥殘留量。基質混合對照品溶液、檢出樣品溶液總離子流圖見圖1，檢出農藥的MRM 檢測結果質譜圖見圖2。

圖1 總離子流圖Fig 1 TIC of 74 pesticides

圖2 3 種檢出農藥的MRM 檢測結果質譜圖Fig 2 Typical mass chromatograms of MRM monitoring results of 3 pesticides

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系 精密吸取系列混合對照品溶液各1 μL，進樣測定，記錄各待測組分的色譜峰面積，以各成分的質量濃度為橫坐標（X）、各成分峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標（Y），進行回歸分析，結果表明，各農藥對照品線性關系良好，見表2。

2.4.2 精密度試驗 取“2.3.5”項下質量濃度為100 ng·mL－1的對照品溶液，分別精密吸取1 μL，進樣測定6 次，計算各農藥對照品峰面積的RSD，結果均小于15%（n＝6），表明儀器的精密度滿足試驗要求。

2.4.3 重復性試驗 取同一黃精樣品（1 號），共6 份，制成供試品后測定，樣品檢出殺蟲脒、苯氟磺胺和腐霉利，故以樣品中的殺蟲脒、苯氟磺胺和腐霉利的峰面積計算含量后求得RSD，結果三者的RSD分別為6.3%、4.3%和5.9%，均小于15%，符合農藥殘留檢測的要求。

2.4.4 加樣回收試驗 取空白樣品3 g，共9 份，分別精密加入混合對照品溶液（0.1 μg·mL－1）50、100、500 μL，每個濃度各重復3 份，同供試品溶液的制備方法處理，即得加樣回收對照品溶液。按“2.1”項下色譜質譜條件測定并計算回收率，結果平均回收率均在60%～140%的農藥數(shù)占比為94.6%，RSD均小于15%，結果見表2。

2.4.5 檢測限（LOD）與定量限（LOQ） 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”中信噪比法計算檢測限與定量限，以上述線性關系考察中質量濃度為5 ng·mL－1的各目標農藥的信噪比。按3 倍信噪比對應的目標物濃度作為檢測限，以10 倍信噪比對應的目標物濃度作為定量限，結果見表2。

表2 相關系數(shù)、線性范圍、檢測限、定量限和加樣回收率Tab 2 Correlation coefficient，Linear range，LOD，LOQ and recovery

續(xù)表2

2.5 樣品測定

按建立的方法處理并測定4 批收集的樣品，結果見表3，樣品中檢出農藥品種為殺蟲脒、苯氟磺胺和腐霉利，其余農藥均未檢出。

表3 黃精農藥殘留測定結果(μg·kg－1)Tab 3 Determination of pesticide residues in 4 batches of Rhizoma Polygonati (μg·kg－1)

3 討論

本文首次將 QuEChERS 前處理方法結合 GCMS/MS 檢測技術用于黃精藥材中多種農藥殘留的快速分析檢測。

經前期調研，黃精以林下套種、杉樹林下種植和大田種植等為主要生產模式，由于是多年生植物，使用農藥消滅病蟲害是保證黃精產量的重要方法之一，并且由于歷史原因耕地土壤中有機氯類、有機磷類等農藥品種會有較大殘留，因此，本研究選擇包含有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類在內的74 種農藥品種作為對照較為全面。

對黃精飲片的前處理條件進行了三個方面的摸索，包括乙腈高速勻漿直接提取、直接提?。玃SA 固相萃取小柱凈化和QuEChERS 法，結果QuEChERS 法能夠較好地除去黃精樣品中的多糖、色素等不利于農藥測定的干擾雜質，降低了因污染對分析儀器穩(wěn)定性的影響。黃精中含多糖成分較多，在粉碎和樣品前處理過程中容易粘連結塊，本試驗在使黃精樣品得到充分冷凍后再立即粉碎，在加入QuEChERS 前處理鹽包之前冰浴冷卻溶液，并在其后的步驟中控制好溶液溫度，避免了粉碎和前處理樣品過程中的結塊現(xiàn)象。采用藥典通則2341 項下推薦的質譜參數(shù)，部分農藥品種的響應偏低，因此本研究對監(jiān)測離子對、碰撞電壓分別進行了優(yōu)化。

本法74 種農藥殘留在4 ～400 ng·mL－1內線性關系良好，檢測限和定量限分別在0.04 ～3.32 和0.14 ～11.05 mg·kg－1，3 個不同濃度添加水平的平均回收率在60%～120%的農藥數(shù)占比為94.6%，RSD均小于15%，適用于不同基原的湘產黃精（黃精和多花黃精）的74 種農藥殘留檢測，對湘產黃精生產種植中農藥監(jiān)控有一定意義。由于本次試驗僅收集4 批次的樣本，代表性不足，并不能完全反映湖南產黃精的農藥污染真實情況。為實現(xiàn)湘產黃精的整體農殘監(jiān)控及用藥安全的全面了解，可通過對產地農藥使用習慣、土壤污染狀況開展實地調研、收集更多產地的樣品后，應用本研究建立的方法進行測定并進行風險評估。