Hsp60表達(dá)下調(diào)通過促進(jìn)TGFBI分泌增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移

陳彥斌 ，張 波，夏先鹍，袁建林，楊 帆

(1.勉縣縣醫(yī)院藥劑科，陜西漢中 724200;；2.勉縣紅十字會醫(yī)院，陜西漢中 724200；3.安康市中醫(yī)醫(yī)院，陜西安康 724299；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710032；5.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院唐都醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710038)

膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，其可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌兩種類型。非肌層浸潤性膀胱癌惡性程度低，預(yù)后較好，然而當(dāng)其進(jìn)展為肌層浸潤型膀胱癌時，其惡性程度顯著升高且進(jìn)展迅速預(yù)后極差，成為膀胱癌致死的主要原因[1]。因此探尋膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制成為膀胱癌臨床監(jiān)測及治療亟待解決的棘手問題。

熱休克蛋白60(heat shock protein 60,HsP60)是定位于線粒體內(nèi)的蛋白伴侶分子，其能夠以腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)依賴的方式促進(jìn)線粒體蛋白的折疊在維持線粒體功能方面發(fā)揮著重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中Hsp60的表達(dá)存在顯著異常且參與腫瘤的惡性進(jìn)展[3-5]。膀胱癌組織中Hsp60表達(dá)下調(diào)能夠顯著影響膀胱癌的放化療及免疫治療效果[6-7]，然而Hsp60否參與膀胱癌的轉(zhuǎn)移目前尚不清楚。

轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白(transforming growth factor beta induced，TGFBI)是一種轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，又稱βig-H3，能夠與整合素α3β1、α5β3和α5β5等相互作用介導(dǎo)細(xì)胞的粘附和遷移[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞中TGFBI的表達(dá)及分泌顯著增高且能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)及轉(zhuǎn)移[8,10]，然而何種因素導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞中TGFBI表達(dá)上調(diào)目前尚不完全明確。

本研究我們系統(tǒng)分析了Hsp60在膀胱癌組織的表達(dá)與膀胱癌分期分級的相關(guān)性，在膀胱癌細(xì)胞中敲低Hsp60表達(dá)后觀察膀胱癌侵襲遷移能力的變化，以期發(fā)現(xiàn)膀胱癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制為臨床預(yù)防及治療轉(zhuǎn)移性膀胱癌提供新的靶分子。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器膀胱癌組織來源于西京醫(yī)院泌尿外科2018年1月1日—2020年12月30日期間確診及收治的95例膀胱癌患者，所有膀胱癌組織均經(jīng)過病理確診為膀胱癌，經(jīng)石蠟包埋為組織石蠟塊，后送南京弗瑞思生物科技有限公司制備為膀胱癌組織芯片。膀胱癌患者血清為同期西京醫(yī)院泌尿外科收治的膀胱癌患者。所有參與實驗的患者均簽署了患者知情同意書并均經(jīng)過西京醫(yī)院倫理委員會審核通過。

人膀胱癌細(xì)胞株UM-UC-3細(xì)胞購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司(iCell Bioscience Inc，Shanghai)；MEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自生工生物工程股份有限公司；青鏈霉素混合液購自索萊寶公司；表達(dá)Hsp60shRNA的腺病毒載體構(gòu)建及包裝、TGFBI siRNA，HIF1α siRNA 以及Hsp60引物購自上海吉瑪公司；實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；即用型免疫組化EliVisionTM plus試劑盒、加強(qiáng)型DAB Plus Kit購自福州邁新試劑公司；小鼠抗人Hsp60單克隆抗體、小鼠抗人β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自Abcam公司；兔抗人HIF1α單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；兔抗人TGFBI多克隆抗體購自Novus生物技術(shù)公司；MitoSOXTMRed線粒體超氧化物指示劑購自賽默飛世爾科技有限公司；TGFBI ELISA檢測試劑盒購自Abcamb公司；FV1000共聚焦顯微鏡和YM310倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司；NovoCyte流式細(xì)胞儀購自艾森生物有限公司。

1.2 免疫組化檢測膀胱癌組織Hsp60的表達(dá)將石蠟組織芯片經(jīng)二甲苯單脫蠟后在體積分?jǐn)?shù)為100%、95%、80%、75%的乙醇中進(jìn)行水化，然后在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)(90 s)；待自然冷卻后用PBS沖洗3 min×3次，3% H2O2的溶液孵育20 min祛除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗3 min×3次；非免疫山羊血清室溫封閉20 min；4 ℃下加一抗體孵育過夜。用PBS洗滌5 min×3次；室溫下加辣根過氧化物酶結(jié)合的EnVision+System二抗孵育2 h；PBS洗滌5 min×3次；加DAB顯色3 min；自來水沖洗。蘇木精染色進(jìn)行復(fù)染；鹽酸乙醇脫色1 s；自來水沖洗，淡氨水反藍(lán)；然后梯度乙醇由低至高及二甲苯洗滌脫水。免疫組化結(jié)果評分評分由2名病理學(xué)家根據(jù)每張玻片(200倍放大)5個鏡下視野內(nèi)陽性細(xì)胞的比例和強(qiáng)度獨立評估。比例評分表示估計的陽性染色腫瘤細(xì)胞比例，分配如下:0(0～9%),1(10%～25%),2(26%～50%),3(51%～75%) or 4(76%～100%)。強(qiáng)度評分表示陽性腫瘤細(xì)胞的平均強(qiáng)度，分為0(未染色)、1(弱染色)、2(中等染色)或3(深染色)。然后將比例和強(qiáng)度分?jǐn)?shù)相乘得到總分，總分范圍為0～12。

1.3 qPCR檢測Hsp60穩(wěn)定干涉膀胱癌細(xì)胞Hsp60的干涉效果使用Trizol從膀胱癌細(xì)胞分離總RNA，DNAse處理后利用SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將得到的cDNA用于qRT-PCR模板，利用Hsp60引物5’-AAGCTCTAAGTACACT-CGTCTTGAATAGG-3’和5’-GCACCACCAGTAGCAATAGCCATAT-3’和β-actin為5’-TGACCCAGATCATGTTTGAG-3’和5’-CGTAC-AGGGATAGCACAG-3’。使用SYBR Green PCR商品化試劑盒擴(kuò)增cDNA。每25 μL反應(yīng)體積包含上述反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 2 μL,SYBR Green mix 12.5 μL，每對寡核苷酸引物10 μmol/L。循環(huán)參數(shù)開始于95 ℃ 5 min的初始變性步驟；95 ℃15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃15 s，共40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA的含量，每個樣品做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 Western-blot檢測Hsp60、TGFBI及HIF-1α等的表達(dá)將6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞棄上清，PBS清洗3遍，用濾紙吸干殘余液體，加70 μL RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30 min,細(xì)胞刮子將裂解的蛋白刮至ependof管，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，收集上清液為細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；5×蛋白上樣緩沖液稀釋，100 ℃煮沸10 min；SDS電泳分離蛋白；轉(zhuǎn)膜至PVDC膜上；BSA封閉30 min；加抗Hsp60抗體(1∶1 000)，抗TGFBI抗體(1∶1 000)或者抗HIF1α抗體(1∶1 000)4 ℃過夜；TBST洗膜 5 min×3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG(1∶10 000)，室溫孵育1 h；TBST洗5 min×4次；化學(xué)發(fā)光顯影；每組實驗至少重復(fù)3次。

1.5 Hsp60穩(wěn)定干涉細(xì)胞系的建立膀胱癌細(xì)胞以6×105的密度接種至6孔板過夜，將包裝好的攜帶Hsp60shRNA基因的腺病毒以感染復(fù)數(shù)(multi-plicity of infection，MOI)=5的密度加入膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中，37 ℃孵育6 h后換液，用不含嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，加入含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基加壓培養(yǎng)1周后，qPCR及Western-blot檢測干涉效果(shRNA-Hsp60:5’-TGCAGGCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGG-AGAATTTTTTC-3’)。

1.6 siRNA干涉膀胱癌細(xì)胞TGFBI或者HIF1α的表達(dá)膀胱癌細(xì)胞以5×105的密度接種至6孔板過夜，按照lipo3000說明書用無血清培養(yǎng)基配置lipo3000包裹siRNA的脂質(zhì)體微球，棄去細(xì)胞上清加500 μL的無血清培養(yǎng)基，將配置好的包裹siRNA的脂質(zhì)體微球點狀均勻加至細(xì)胞培養(yǎng)上清中，米字搖晃，37 ℃培養(yǎng)6 h后,換含血清的正常培養(yǎng)基，72 h后，Western-blot檢測干涉效果(TGFBI siRNA：CGGGAAGGCGATCATCTCCAA；HIF1α siRNA：GCAAGGCCTTACATGTTAA；siRNA Ctrl：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)。

1.7 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清TGFBI的濃度Hsp60穩(wěn)定干涉的膀胱癌細(xì)胞及對照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集上清。按照TGFBI ELISA檢測試劑盒中說明書的操作方法進(jìn)行檢測;膀胱癌患者外周血需取3 mL于無抗凝管中，2 h之內(nèi)分離血清，-80 ℃ 保存，然后使用ELISA檢測試劑盒。

1.8 Transwell實驗檢測干涉Hsp60表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變將Hsp60穩(wěn)定干涉的膀胱癌細(xì)胞及對照組細(xì)胞以3×104的密度接種至鋪有Matrige膠或者沒有鋪Matrige膠的Transwell小室的上室中，下腔室含有0.6 mL含100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞孵育12 h(轉(zhuǎn)移)或24 h(侵襲)后,取上室用棉簽擦去小室內(nèi)部未穿出的細(xì)胞，用40 g/L多聚甲醛固定上室穿出的細(xì)胞，用40 g/L結(jié)晶紫溶液染色。顯微鏡下以20倍放大率捕捉5個隨機(jī)視場進(jìn)行分析。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。

1.9 劃痕實驗檢測干涉Hsp60表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞遷移能力的改變在24孔板上接種膀胱癌細(xì)胞，待細(xì)胞密度長至80%時，用200 μL移液槍的槍頭在24孔培養(yǎng)板劃一條等寬的直線，用無血清培養(yǎng)基將劃落的細(xì)胞清洗干凈后再加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，12 h在20倍物鏡下捕捉圖像。采用Image J軟件(NIH,MD,USA)計算創(chuàng)面愈合面積。遷移率(%)=(0 h創(chuàng)面面積12 h或者24 h創(chuàng)面面積)/0 h創(chuàng)面面積×100%。

1.10 MitoSOX檢測線粒體活性氧的變化將膀胱癌細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞密度長至70%左右時棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清。用PBS洗3次，用無血清培養(yǎng)基按比例1∶1 000稀釋加DCFH-DA熒光探針，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育25 min，棄去上清，PBS洗滌3次，再加入無血清培養(yǎng)基。共聚焦顯微鏡下攝取熒光圖片，并計算熒光強(qiáng)度。每個樣品3個復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱癌組織Hsp60表達(dá)降低與膀胱癌的分化及臨床密切相關(guān)免疫組化檢測膀胱癌組織Hsp60蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：Hsp60蛋白局限性表達(dá)在膀胱癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，且在浸潤性膀胱癌組織中的表達(dá)水平顯著低于非浸潤性膀胱癌組織(圖1A),免疫組化評分進(jìn)一步確認(rèn)：與非浸潤性膀胱癌組織相比，Hsp60在浸潤性膀胱癌組織中的表達(dá)顯著降低(圖1B)。根據(jù)免疫組化評分中位數(shù)(5.468±1.846)將膀胱癌患者分為Hsp60高表達(dá)組及Hsp60低表達(dá)組。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果進(jìn)一步證實：膀胱癌組織Hsp60的表達(dá)與膀胱癌的臨床分期，分級以及復(fù)發(fā)等顯著相關(guān)，而與膀胱癌患者的年齡、性別、飲酒史、抽煙史等沒有顯著的相關(guān)性(表1)。

A：免疫組化檢測Hsp60蛋白的表達(dá)差異；B：Hsp60的免疫組化評分值。圖1 免疫組化檢測膀胱癌組織Hsp60蛋白的表達(dá)

表1 Hsp60表達(dá)與膀胱癌患者臨床參數(shù)的相關(guān)性 [例(%)]

2.2 干涉Hsp60表達(dá)膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移能力顯著增強(qiáng)利用表達(dá)Hsp60shRNA的重組腺病毒載體感染膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3，構(gòu)建Hsp60穩(wěn)定干涉的膀胱癌細(xì)胞株。qPCR及Western-blot檢測Hsp60的干涉效果，結(jié)果顯示：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中Hsp60的mRNA及蛋白表達(dá)均被顯著抑制(圖2A、B)。進(jìn)一步檢測Hsp60表達(dá)變化對膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。Transwell實驗結(jié)果顯示：干涉膀胱癌細(xì)胞Hsp60表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移能力均顯著增強(qiáng)(圖2C)。劃痕實驗進(jìn)一步證實：Hsp60干涉后膀胱癌細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)(圖2D)。這些結(jié)果均提示：Hsp60表達(dá)降低能夠增強(qiáng)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

A:qPCR檢測Hsp60 mRNA的表達(dá)；B：Western-blot檢測蛋白的表達(dá)；C：Transwell實驗檢測膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移；D：劃痕實驗檢測膀胱癌細(xì)胞遷移。圖2 干涉Hsp60表達(dá)后，檢測膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變

2.3 干涉膀胱癌細(xì)胞Hsp60表達(dá)促進(jìn)TGFBI的表達(dá)RNA-Seq分析結(jié)果顯示：與對照組相比，Hsp60穩(wěn)定干涉膀胱癌細(xì)胞中TGFBI基因的表達(dá)顯著升高(圖3A)。Western-blot檢測Hsp60表達(dá)對TGFBI蛋白的影響，結(jié)果顯示：干涉Hsp60表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞中TGFBI蛋白表達(dá)較對照組顯著升高(圖3B)。ELISA檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，Hsp60干涉的膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGFBI的分泌也顯著增加(圖3C)。進(jìn)一步檢測18例Hsp60高表達(dá)膀胱癌患者及20例Hsp60低表達(dá)膀胱患者血清中TGFBI水平，結(jié)果顯示：Hsp60低表達(dá)膀胱癌患者血清中TGFBI的表達(dá)水平顯著高于Hsp60高表達(dá)膀胱癌患者血清中的TGFBI(圖3D)。這些結(jié)果均提示：Hsp60表達(dá)降低促進(jìn)了TGFBI的表達(dá)。

A：RNA-seq分析基因的差異表達(dá)；B：Western-blot檢測Hsp60及TGFBI蛋白；C：ELISA檢測培養(yǎng)上清中的TGFBI蛋白；D：ELISA檢測血清TGFBI蛋白。圖3 Hsp60對TGFBI表達(dá)的影響

2.4 膀胱癌細(xì)胞中Hsp60表達(dá)降低通過促進(jìn)TGFBI促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移文獻(xiàn)報道TGFBI是促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移重要因素，因此我們進(jìn)一步探索干涉Hsp60表達(dá)能否通過TGFBI促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移。利用TGFBI siRNA特異性阻斷Hsp60穩(wěn)定干涉膀胱癌細(xì)胞中TGFBI的表達(dá)，Transwell結(jié)果顯示：干涉TGFBI表達(dá)后，Hsp60表達(dá)降低導(dǎo)致的膀胱癌細(xì)胞侵襲遷移能力增強(qiáng)被顯著抑制；同時劃痕實驗也證實：干涉TGFBI后，Hsp60表達(dá)降低所導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)也被顯著抑制。這些結(jié)果均提示：干涉Hsp60表達(dá)所導(dǎo)致的膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移是通過TGFBI介導(dǎo)的。

2.5 干涉Hsp60表達(dá)降低通過ROS/HIF1a通路促進(jìn)TGFBI的表達(dá)我們首先檢測膀胱癌細(xì)胞Hsp60表達(dá)降低能否影響ROS/HIF1α信號通路。MitoSOX染色結(jié)果顯示：干涉Hsp60表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS的水平顯著升高(圖5A、B)；同時Western-blot結(jié)果顯示：干涉Hsp60表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞內(nèi)HIF1α的表達(dá)顯著升高(圖5B)。利用MitoTEMP祛除Hsp60穩(wěn)定干涉膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的線粒體ROS后，Western-blot結(jié)果顯示：Hsp60干涉導(dǎo)致的HIF1α及TGFBI表達(dá)升高均被顯著抑制(圖5C)；同時利用siRNA干涉Hsp60穩(wěn)定干涉膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的HIF1α表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Hsp60敲低導(dǎo)致TGFBI表達(dá)升高也被顯著抑制(圖5D)。這些結(jié)果提示:干涉Hsp60表達(dá)誘導(dǎo)的TGFBI表達(dá)是通過ROS/HIF1α通路調(diào)控的。

A、B：Transwell實驗檢測膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移；C、D：劃痕實驗檢測膀胱癌細(xì)胞的遷移。圖4 干涉TGFBI顯著抑制Hsp60干涉導(dǎo)致的膀胱癌細(xì)胞侵襲遷移增強(qiáng)

A：MitoSOX檢測膀胱癌細(xì)胞ROS水平；B：統(tǒng)計學(xué)分析膀胱癌細(xì)胞ROS水平；C～E：Western-blot;C：干涉Hsp60表達(dá)顯著增加膀胱癌細(xì)胞HIF1α的表達(dá)；D:MitoTEMP去除線粒體ROS，可顯著降低Hsp60穩(wěn)定干涉膀胱癌細(xì)胞內(nèi)TGFBI的表達(dá)；E:HIF1α siRNA膀胱癌可顯著降低Hsp60穩(wěn)定干涉膀胱癌細(xì)胞內(nèi)TGFBI的表達(dá)。圖5 干涉Hsp60表達(dá)可通過ROS/HIF1α信號通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞TGFBI的表達(dá)

3 討 論

本研究揭示了Hsp60在浸潤性膀胱癌組織中的表達(dá)較非浸潤性膀胱癌組織顯著降低，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示：Hsp60表達(dá)與膀胱癌患者的臨床分期、分級及復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。細(xì)胞學(xué)實驗證實：干涉Hsp60表達(dá)可通過ROS/HIF1α信號通路上調(diào)TGFBI表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

以往的研究發(fā)現(xiàn)Hsp60與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。PISELLI等[11]發(fā)現(xiàn)Hsp60與CD44v5/v6,ICAM-1等協(xié)同表達(dá)能夠促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)Hsp60在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。ZHANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織Hsp60表達(dá)顯著下調(diào)且能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的去分化及侵襲轉(zhuǎn)移。膀胱癌組織Hsp60表達(dá)下調(diào)與膀胱癌患者預(yù)后不良有關(guān)[13]。在侵襲性或高危淺表性膀胱癌中，Hsp60表達(dá)低的膀胱癌患者其對新輔助化療的反應(yīng)性越差[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)：與非浸潤性膀胱癌相比，Hsp60在浸潤性膀胱癌組織中的表達(dá)顯著降低。干涉Hsp60表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移能力顯著增強(qiáng)，我們的研究揭示了Hsp60表達(dá)降低促進(jìn)膀胱癌惡性進(jìn)展具體機(jī)制，為預(yù)測膀胱癌的轉(zhuǎn)移提供了新的標(biāo)記分子同時為轉(zhuǎn)移性膀胱癌的治療提供了新的潛在靶點。

TGFBI作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白其能夠通過與黏附素結(jié)合，激活金屬蛋白酶或者促進(jìn)新生血管生成等方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中TGFBI的表達(dá)顯著上調(diào)且與腫瘤分級和轉(zhuǎn)移潛能的增加相關(guān)[15]。在骨肉瘤、前列腺癌細(xì)胞中抑制TGFBI表達(dá)可顯著降低腫瘤的轉(zhuǎn)移[16-17]。在胰腺癌癥轉(zhuǎn)移模型中，分離出血液循環(huán)癌細(xì)胞，這些細(xì)胞在體內(nèi)和體外都有高的轉(zhuǎn)移潛能，通過對這些高惡性細(xì)胞的mRNA分析發(fā)現(xiàn)，TGFBI是原發(fā)和惡性胰腺癌細(xì)胞株中變化幅度最大的基因[18]。乳腺癌細(xì)胞中TGFBI的表達(dá)升高能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT及轉(zhuǎn)移[9]。膀胱癌細(xì)胞TGFBI表達(dá)顯著上調(diào)且能夠增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)干涉膀胱癌細(xì)胞Hsp60表達(dá)能夠顯著促進(jìn)TGFBI的表達(dá)，利用siRNA阻斷膀胱癌細(xì)胞Hsp60干涉膀胱癌細(xì)胞內(nèi)TGFBI的表達(dá)可顯著抑制Hsp60表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能增加。我們的研究揭示了Hsp60表達(dá)下調(diào)促進(jìn)膀胱癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。

TGFBI的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1的調(diào)控[18]?；钚匝醪粌H在缺氧條件下上調(diào)HIF-1的表達(dá)，還可以在多種應(yīng)激狀態(tài)下上調(diào)HIF1的表達(dá)。Hsp60是維持線粒體活氧化呼吸鏈ROS生成的重要因素[19]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中干涉Hsp60表達(dá)能夠顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。蛋白組學(xué)分析揭示：Hsp60沉默增能夠?qū)е戮€粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物I亞基的下調(diào),導(dǎo)致呼吸鏈功能紊亂，產(chǎn)生過量的ROS[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)干涉Hsp60表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞ROS水平及HIF1a的表達(dá)均顯著升高。清除ROS或者抑制HIF1a表達(dá)均可抑制Hsp60干涉導(dǎo)致TGFBI表達(dá)上調(diào)，提示膀胱癌細(xì)胞Hsp60下調(diào)通過ROS/HIF1a信號通路促進(jìn)膀TGFBI表達(dá)。

我們的研究揭示了Hsp60在膀胱癌組織表達(dá)下調(diào)促進(jìn)膀胱侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，為臨床膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的監(jiān)測及治療提供新的潛在靶點。