膀胱癌細(xì)胞TFAM下調(diào)介導(dǎo)mtDNA應(yīng)激抑制NK細(xì)胞殺傷的作用機(jī)制

楊 帆，尚炳亮，劉 靜，姚田軍，周幸春，王 禾，張 波

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院唐都醫(yī)院泌尿外科，西安 710038；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710069)

自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞是機(jī)體防御腫瘤的第一道防線，因其不需要致敏可直接殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)分泌干擾素γ(interferonγ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白細(xì)胞介素8(Interleukin 8,IL-8)等細(xì)胞因子而成為繼T細(xì)胞之后最有潛力的腫瘤免疫治療新星[2]。然而，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤局部浸潤(rùn)的NK細(xì)胞功能存在顯著異常并成為促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的重要因素之一[3]。因此，探索腫瘤逃避NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

人類白細(xì)胞抗原-G(human leukocyte antigen G，HLA-G)屬于非經(jīng)典HLA Ⅰ類抗原，其分子能夠與β2微球蛋白結(jié)合形成類似經(jīng)典HLA Ⅰ類分子的結(jié)構(gòu)。HLA-G能夠與免疫細(xì)胞表面的抑制性受體即免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(immunoglobulin-like transcript，ILT)2、ILT4以及殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)2DL4等結(jié)合而有效抑制CD4+T細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的殺傷。正常組織中HLA-G僅表達(dá)于母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞和胸腺上皮發(fā)揮局部免疫抑制作用。在腫瘤組織中，HLA-G表達(dá)顯著升高。在腎癌、肝癌、卵巢癌以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)HLA-G可抑制NK細(xì)胞的殺傷，HLA-G中和性抗體可恢復(fù)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷[10]。研究顯示腫瘤微環(huán)境中的缺氧和白細(xì)胞介素1β(Inter-leukin 1β，IL-1β)、干擾素α(interferon α，IFNα)、IFN-γ、白細(xì)胞介素6(inter-leukin 6，IL-6)等細(xì)胞因子水平增高是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞HLA-G表達(dá)上調(diào)主要主要因素[10]。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)是一種由核基因編碼的線粒體轉(zhuǎn)錄因子，其在線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及擬核結(jié)構(gòu)的維持方面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。TFAM表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致mtDNA應(yīng)激的發(fā)生，主要表現(xiàn)為：線粒體功能異常，mtDNA擬核結(jié)構(gòu)松散同時(shí)mtDNA從線粒體內(nèi)溢出至細(xì)胞質(zhì)被胞質(zhì)模式識(shí)別受體TOLL樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR9),環(huán)GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)及炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)等所識(shí)別激活免疫相關(guān)信號(hào)通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分泌IL-10、IL-1β以及干擾素等細(xì)胞因子[13-14]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TFAM的表達(dá)水平存在顯著異常且與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，然而其在膀胱癌組織的表達(dá)及其是否參與膀胱癌的惡性進(jìn)展尚不清楚。

本研究首次在膀胱癌組織及癌旁組織中分析了TFAM的表達(dá)及其與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步分析了TFAM降低通過促進(jìn)HLA-G分子的表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞逃避NK細(xì)胞攻擊的作用及機(jī)制，闡明了膀胱癌細(xì)胞免疫逃逸的新機(jī)制，有望為膀胱癌免疫治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料膀胱癌組織芯片(KX-BL192a)購(gòu)自北京龍邁達(dá)斯科技開發(fā)有限公司；即用型免疫組化EliVisionTMplus檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；Gibco胎牛血清購(gòu)自生工生物工程有限公司；UM-UC-3、T24膀胱癌細(xì)胞系及NK細(xì)胞系購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑和試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；兔抗人TFAM單克隆抗體(ab176558)、鼠抗人HLA-G單克隆抗體(ab7759)及鼠抗人單克隆抗體(ab8226)均購(gòu)Abcamb公司；Alexa Fluor?488 Mouse IgG2a抗人HLA-G(400237)及鼠抗人HLA-G中和抗體(335902)均購(gòu)自Biolegend公司,LDH試劑盒購(gòu)自江萊生物科技有限公司；熒光共聚焦顯微鏡FV1000和倒置顯微鏡YM310購(gòu)自O(shè)lympus公司；NovoCyte流式細(xì)胞儀購(gòu)自艾森生物有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膀胱癌組織TFAM蛋白的表達(dá)及免疫組化結(jié)果評(píng)分膀胱癌石蠟組織芯片經(jīng)二甲苯及由高至低濃度梯度乙醇脫臘；PBS清洗3 min×3次；檸檬酸鈉高壓修復(fù)90 s冷卻至室溫；PBS清洗3 min×3次；30 g/L雙氧水室溫孵育15 min祛除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS清洗3 min×3次；山羊血清室溫封閉30 min；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；甩去一抗PBS清洗5 min×3次；加即用型生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育20 min； PBS清洗5 min×3次；加辣根光氧化物酶標(biāo)記標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,DAB顯色；自來水沖洗后加蘇木素孵育5 min,自來水沖洗；5 g/L的鹽酸乙醇分化；淡氨水反藍(lán)；由低至高梯度乙醇二甲苯脫水；中性樹膠封片。免疫組化結(jié)果由2名病理學(xué)專家進(jìn)行判讀：高倍鏡下(×200)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)除以視野面積為每個(gè)視野的平均染色強(qiáng)度，取3個(gè)視野的細(xì)胞染色強(qiáng)度平均值為每個(gè)樣本的平均染色染色強(qiáng)度。

1.3 構(gòu)建TFAM穩(wěn)定干涉或過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞系6孔板以5×105個(gè)/孔的密度接種膀胱癌細(xì)胞；24 h后，將由上海吉瑪公司訂購(gòu)的TFAM穩(wěn)定干涉及過表達(dá)的慢病毒載體按照說明書上的MOI值加入細(xì)胞上清中感染膀胱癌細(xì)胞；6 h后棄去上清換液成含嘌呤霉素的培養(yǎng)上清，以含嘌呤霉素的培養(yǎng)上清持續(xù)培養(yǎng)1周直至未感染細(xì)胞完全死去，繼續(xù)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)并收集蛋白做Western-blot檢測(cè)干涉及過表達(dá)的效果。

1.4 qPCR檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞TFAM及HLA-G基因的表達(dá)按照商品化試劑盒提取TFAM穩(wěn)定干涉及過表達(dá)細(xì)胞的總mRNA并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板以上海吉瑪公司合成的TFAM引物：F-5’-GGCAAGUUGUC CAAAGAAACC-3’R-5’UUUCUUUGGACAACUU GCCAA-3’；HLA-G引物：F-5’CCATGTGGTATTT CAGCGCC-3及R-5’TGTTCCGTGTCTCCTCTTCC-3’。人β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參其引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’及5’-GGCT GTTGTCATACTTCTCATGG-3’。按照qPCR商品化試劑盒SYBR Green PCR Kit的說明書操作步驟進(jìn)行操作。β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA的含量，每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western-blot檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞TFAM及HLA-G表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TFAM穩(wěn)定干涉或過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞，棄上清PBS洗3遍；濾紙吸干PBS后用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白；BSA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；加上樣緩沖液煮沸；經(jīng)SDS凝膠電泳分離蛋白條帶；將蛋白轉(zhuǎn)移至PDVC膜上；TBST清洗3遍；加封閉液室溫封閉1 h；加一抗(TFAM 1∶1 000，HLA-G 1∶500)4 ℃過夜；TBST清洗5 min×3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠兔的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h；TBST洗5 min×3次；加化學(xué)發(fā)光液發(fā)光并使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞膜型HLA-G的表達(dá)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TFAM穩(wěn)定干涉及過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106；加PBS洗滌5 min×3次；加多聚甲醛固定；加PBS洗滌5 min×3次；按照空白對(duì)照組(不加抗體)，同型對(duì)照組(加同型無關(guān)抗體)及待測(cè)抗體組(抗HLA-G)分別加相關(guān)抗體室溫孵育40 min；加PBS洗滌5 min×3次；加熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min；加PBS洗滌5 min×3次；流式檢測(cè)。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，平均值為其最終檢測(cè)值。

1.7 ELISA檢測(cè)NK細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-8的表達(dá)TFAM穩(wěn)定干涉及過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)上清,或者在TFAM穩(wěn)定干涉的膀胱癌細(xì)胞與在共培養(yǎng)體系中加入IgG及抗HLA-G中和抗體與NK細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后收集上清，T24 EV及T24 TFAM細(xì)胞分別加入PBS及重組HLA-G后與NK細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。將以上細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到包被抗HLA-G的商品化ELISA試劑盒中，按照試劑盒說明書完成ELISA檢測(cè)，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔其A值的平均值為樣本最終檢測(cè)值。

1.8 LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷將TFAM穩(wěn)定干涉或者過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞以1×105的密度種至圓底96孔板中；24 h后加入NK細(xì)胞，按照效靶比1∶1、5∶1、10∶1以及20∶1的比例共培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞自然釋放組和最大釋放組，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔；37 ℃孵育；2 h后取出培養(yǎng)物，吸取各孔上清0.1 mL加于另一培養(yǎng)板孔中，每孔加入新鮮配制的LDH底物溶液0.1 mL，室溫避光反應(yīng)10～15 min；每孔加入1 mol/L檸檬酸終止液30 μL，以終止酶促反應(yīng)；用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)下讀取各孔A值，并計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.9 Picogreen及Mitotracker檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞雙鏈DNA及線粒體的定位將TFAM穩(wěn)定干涉及過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞接種至6孔板；24 h后棄去培養(yǎng)上清用無血清培養(yǎng)基洗3遍；加1∶1 000稀釋的Picogreen及Mitotracker Red CMXRos 37 ℃孵箱共培養(yǎng)30 min；無血清培養(yǎng)基洗3遍；在激光共聚焦顯微鏡下觀察mtDNA及線粒體的共定位。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A在膀胱癌組織中的表達(dá)較癌旁組織顯著降低且與膀胱癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)免疫組化檢測(cè)膀胱癌及癌旁組織中TFAM的表達(dá)，結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，膀胱癌組織中TFAM表達(dá)顯著降低(圖1A)。免疫組化評(píng)分結(jié)果顯示：膀胱癌組織中TFAM免疫組化評(píng)分值為5.589±2.346，顯著低于癌旁組織中TFAM的免疫組化評(píng)分值7.321±1.453(圖1B)。根據(jù)膀胱癌組織中TFAM表達(dá)水平(免疫組化評(píng)分中位數(shù))將膀胱癌患者分為TFAM高表達(dá)組和TFAM低表達(dá)組。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示：TFAM低表達(dá)越低的膀胱癌患者其總生存期越短，復(fù)發(fā)率越高，TFAM表達(dá)越高的膀胱癌患者其預(yù)后越好，復(fù)發(fā)率越低(圖1C、D)。

A：膀胱癌及癌旁組織中TFAM蛋白的表達(dá)；B：TFAM表達(dá)的免疫組化評(píng)分;C：總生存率；D復(fù)發(fā)率。圖1 免疫組化檢測(cè)TFAM在膀胱癌及癌旁組織的表達(dá)水平及其對(duì)膀胱癌患者預(yù)后的影響

2.2 TFAM下調(diào)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞抑制NK細(xì)胞的殺傷利用腺病毒載體感染TFAM高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株UM-UC-3和TFAM低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株T24，成功構(gòu)建了TFAM穩(wěn)定干涉的膀胱癌細(xì)胞株UM-UC-3 shCtrl、UM-UC-3 shTFAM-1、UM-UC-3 shTFAM-2及TFAM穩(wěn)定過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株T24 EV及T24 TFAM(圖2A、B)。將TFAM穩(wěn)定干涉及過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株與NK細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中NK細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-8的表達(dá)，LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。結(jié)果顯示與UM-UC-3 shCtrl細(xì)胞相比，UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后其培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-8的分泌顯著減少同時(shí)NK細(xì)胞的殺傷能力顯著降低(圖2C,D左側(cè))。反之，T24 TFAM細(xì)胞與NK共培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-8等NK細(xì)胞因子的分泌水平及NK細(xì)胞的殺傷能力較T24 EV組均顯著升高，提示膀胱癌細(xì)胞TFAM表達(dá)降低能夠抑制NK細(xì)胞對(duì)其殺傷(圖2C、D右側(cè))。

A：TFAM mRNA的表達(dá)；B：TFAM蛋白的表達(dá)；C：NK細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)；D：NK細(xì)胞殺傷能力。圖2 TFAM表達(dá)水平對(duì)膀胱癌細(xì)胞逃避NK細(xì)胞殺傷的影響

2.3 下調(diào)TFAM可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞表達(dá)HLA-GqPCR檢測(cè)TFAM對(duì)HLA-G基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：與UM-UC-3 shCtrl相比，UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細(xì)胞中HLA-G mRNA的表達(dá)水平顯著升高；反之，在T24 TFAM細(xì)胞中HLA-G mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組T24 EV細(xì)胞顯著降低(圖3A)。Western-blot結(jié)果在蛋白水平確認(rèn)：UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細(xì)胞中HLA-G蛋白的表達(dá)較對(duì)照組UM-UC-3 shCtrl顯著增高，T24 TFAM細(xì)胞中TFAM蛋白表達(dá)較T24 EV組顯著減少(圖3B)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)模型HLA-G的表達(dá)，結(jié)果確認(rèn)：在UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細(xì)胞中，膜HLA-G表達(dá)隨著TFAM表達(dá)的敲低而升高，在T24細(xì)胞中隨著TFAM的過表達(dá)，膜HLA-G的表達(dá)減少(圖3C、D)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TFAM表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)HLA-G的表達(dá)。

A:HLA-G mRNA的表達(dá)；B：HLA-G蛋白的表達(dá)；C：細(xì)胞膜HLA-G的表達(dá)。圖3 TFAM表達(dá)水平對(duì)HLA-G表達(dá)的影響

2.4 TFAM下調(diào)通過誘導(dǎo)HLA-G表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞逃避NK細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞膜HLA-G表達(dá)升高能夠抑制NK細(xì)胞的殺傷[10]，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞TFAM敲低能否通過促進(jìn)HLA-G表達(dá)抑制NK細(xì)胞的殺傷。為驗(yàn)證此假說我們將TFAM穩(wěn)定干涉的膀胱癌細(xì)胞系UM-UC-3 shTFAM-1或UM-UC-3 shTFAM-2與NK細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)在共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入HLA-G的中和抗體87G以阻斷HLA-G的功能，結(jié)果顯示：87G可顯著恢復(fù)TFAM干涉導(dǎo)致的NK細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-8等分泌減少及NK細(xì)胞殺傷抑制(圖4A、C)。相反，在TFAM過表達(dá)的T24 TFAM細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)基中加入重組可溶性HLA-G(rHLA-G)蛋白后，可顯著抑制TFAM過表達(dá)介導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷及IFN-γ、TNF-α和IL-8等細(xì)胞因子的釋放(圖4B、D)。這些結(jié)果均提示TFAM下調(diào)可通過上調(diào)HLA-G表達(dá)介導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞逃避NK細(xì)胞的殺傷。

A、B：NK細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子的分泌；C、D：NK細(xì)胞的殺傷能力檢測(cè)。圖4 TFAM通過促進(jìn)HLA-G表達(dá)抑制NK細(xì)胞的活化與殺傷

2.5 TFAM表達(dá)下調(diào)通過誘導(dǎo)線粒體DNA應(yīng)激促進(jìn)HLA-G的表達(dá)TFAM是維護(hù)mtDNA穩(wěn)態(tài)的重要分子，TFAM表達(dá)降低能夠誘導(dǎo)mtDNA應(yīng)激發(fā)生[13]。我們采用雙鏈DNA染料Picogreen和線粒體特異性染料Mitotracker共染膀胱癌細(xì)胞中的mtDNA及線粒體結(jié)果發(fā)現(xiàn)與UM-UC-3 shCtrl細(xì)胞相比，UM-UC-3 shTFAM-1和UM-UC-3 shTFAM-2細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA擬核結(jié)構(gòu)顯著變大且松散，同時(shí)發(fā)現(xiàn)mtDNA由線粒體外溢至胞質(zhì)(圖5A)。相反，在T24細(xì)胞中過表達(dá)TFAM可導(dǎo)致線粒體擬核結(jié)構(gòu)變得緊致，線粒體外溢至胞質(zhì)減少(圖5B)。分離胞質(zhì)mtDNA并利用qPCR檢測(cè)其拷貝數(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，UM-UC-3 shTFAM-1和UM-UC-3 shTFAM-2細(xì)胞胞質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)較UM-UC-3 shCtrl顯著升高；T24 TFAM較T24 EV胞質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)顯著降低(圖5C)。這些結(jié)果表明在膀胱癌細(xì)胞內(nèi)干涉TFAM表達(dá)可導(dǎo)致mtDNA應(yīng)激的發(fā)生。將脂質(zhì)體包裹DNA酶Ⅰ轉(zhuǎn)染至TFAM 穩(wěn)定干涉的UM-UC-3細(xì)胞中以降解TFAM干涉導(dǎo)致的mtDNA應(yīng)激導(dǎo)致的外溢至胞質(zhì)中的線粒體DNA(圖5C)，qPCR結(jié)果顯示：DNA酶Ⅰ能夠顯著抑制TFAM干涉所誘導(dǎo)HLA-G mRNA表達(dá)，Western-blot及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步在蛋白水平證實(shí)，DNA酶Ⅰ可顯著抑制TFAM干涉所導(dǎo)致的HLA-G蛋白的表達(dá)增高(圖5D、E)。反之,在TFAM過表達(dá)的T24細(xì)胞中加入阻斷線粒體呼吸功能的魚藤酮可顯著回復(fù)TFAM過表達(dá)所導(dǎo)致的細(xì)胞質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)減少(圖5C)以及HLA-G mRNA及蛋白的表達(dá)減少(圖5D、F)。這些結(jié)果均顯示TFAM表達(dá)降低是通過誘導(dǎo)線粒體DNA應(yīng)激來促進(jìn)HLA-G的表達(dá)的。

A、B：線粒體DNA擬核結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞質(zhì)線粒DNA；C：細(xì)胞胞質(zhì)線粒體DNA的數(shù)目；D：HLA-G蛋白的表達(dá)。E、F：細(xì)胞膜HLA-G的表達(dá)。圖5 TFAM表達(dá)通過誘導(dǎo)線粒體DNA應(yīng)激促進(jìn)HLA-G的表達(dá)

3 討 論

逃避NK細(xì)胞免疫監(jiān)視是腫瘤惡性進(jìn)展的重要因素之一，但其機(jī)制尚不完全清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中線粒體重要轉(zhuǎn)錄因子TFAM表達(dá)較癌旁組織顯著降低且TFAM表達(dá)水平與膀胱癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。干涉膀胱癌細(xì)胞中TFAM表達(dá)通過上調(diào)HLA-G抑制NK細(xì)胞殺傷，進(jìn)一步揭示了TFAM下調(diào)通過介導(dǎo)mtDNA應(yīng)激促進(jìn)HLA-G表達(dá)的機(jī)制。

TFAM在腫瘤組織中的表達(dá)存在顯著異常且與腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[15-18]。例如：在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)直腸組織中TFAM基因發(fā)生截?cái)囿w突變導(dǎo)致TFAM蛋白水平顯著減少，使得直腸癌細(xì)胞變得的凋亡抵抗[19]。在腎癌細(xì)胞中干涉TFAM表達(dá)可促進(jìn)腎癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥[20]。口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中TFAM表達(dá)減少導(dǎo)致可導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)減少引起癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥[21]。我們的研究首次利用免疫組化的方法在40對(duì)膀胱癌及癌旁組織中檢測(cè)了TFAM的表達(dá)并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：膀胱癌組織中TFAM的表達(dá)較癌旁組織顯著降低，且TFAM表達(dá)越低的膀胱癌患者其預(yù)后越差，提示膀胱癌組織中TFAM表達(dá)降低參與了膀胱癌的惡性進(jìn)展。

TFAM是調(diào)控mtDNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制維護(hù)mtDNA拷貝數(shù)及穩(wěn)定的重要調(diào)蛋白，干涉TFAM表達(dá)可導(dǎo)線粒體功能異常腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌細(xì)胞lon蛋白酶通過降解TFAM誘導(dǎo)mtDNA外溢至細(xì)胞質(zhì)促進(jìn)PD-L1及吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO-1)的表達(dá)[22-25]。我們發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中干涉TFAM表達(dá)能夠促進(jìn)HLA-G的表達(dá)，HLA-G能夠與NK細(xì)胞膜的抑制性受體LIR-2、ILT-4及KIR2DL4結(jié)合抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。此外HLA-G還能夠通過促進(jìn)HLA-E表達(dá)的方式抑制NK細(xì)胞的活化。我們首次在膀胱癌細(xì)胞中揭示了TFAM表達(dá)降低通過促進(jìn)HLA-G的表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞抑制NK細(xì)胞的殺傷。

HLA-G屬于重要的免疫抑制分子，目前已在黑色素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、膀胱癌以及膀胱癌等多種腫瘤組織中檢測(cè)到HLA-G高表達(dá)[9]。腫瘤組織中HLA-G的表達(dá)受到表觀遺傳學(xué)、缺氧、應(yīng)激、以及IL-10、干擾素以及IL-1β等細(xì)胞因子的調(diào)控[10]。TFAM表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)mtDNA應(yīng)激的發(fā)生其最主要特征為可激活免疫相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)INFα及INFβ等Ⅰ型干擾素及IL-1β等細(xì)胞因子的分泌[26]。有研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織mtDNA顯著減少，且伴隨IL-1β的顯著升高[25]。我們發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞內(nèi)干涉TFAM表達(dá)能夠通過誘導(dǎo)mtDNA應(yīng)激促進(jìn)HLA-G的表達(dá)。然而本研究中我們僅證實(shí)了TFAM誘導(dǎo)線粒體DNA應(yīng)激通過促進(jìn)胞質(zhì)mtDNA來誘導(dǎo)了HLA-G的釋放，具體是通過哪一種炎癥信號(hào)通路來激活的需要做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上，TFAM在前膀胱癌組織中的表達(dá)顯著減少，且TFAM表達(dá)越低的膀胱癌患者其預(yù)后越差，提示TFAM可以作為判斷膀胱癌預(yù)后的重要標(biāo)記物。在膀胱癌細(xì)胞中敲低TFAM表達(dá)可誘導(dǎo)mtDNA應(yīng)激上調(diào)HLA-G表達(dá)來逃避NK細(xì)胞的殺傷。本研究以線粒體為視角，揭示了膀胱癌細(xì)胞免疫逃逸的新機(jī)制為膀胱癌的免疫治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。