SIRT1參與硫化氫改善同型半胱氨酸誘導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激損傷

魏海軍 王玥 胡亞 趙美 伍愛榮 趙忠桂 張慶麗

[摘要] 目的 探討沉默信號調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是否參與硫化氫（H2S）改善同型半胱氨酸 （Hcy）誘導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激損傷。 方法 隨機(jī)將雄性SD大鼠分成9組，即正常（CON）組、Hcy（0.2 μmol）（H1）組、Hcy（0.6 μmol）（H2）組、Hcy（2.0 μmol）（H3）組、Hcy（0.6 mol）+NaHS（30 μmol/kg）（H2+N1）組、Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）（H2+N2）組、正常+NaHS（100 μmol/kg）（C+N2）及Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+ SIRT1的抑制劑Sirtinol（10 nmol）（H2+N2+S）組、正常+Sirtinol（10 nmol）（C+S）組，每組10只。采用側(cè)腦室微量注射Hcy建立Hcy神經(jīng)毒性模型，并在Hcy注射前2 d以腹腔注射NaHS及側(cè)腦室注射Sirtinol 共同預(yù)處理 SD大鼠2 d，然后與 Hcy共處理7 d;各種試劑盒檢測大鼠海馬總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。 結(jié)果 與CON 組比較，H1、H2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降（P<0.01）及MDA表達(dá)水平升高（P<0.001）;與H2組比較，H2+N2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯上升（P<0.01）及MDA表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。此外，與H2+N2組比較，H2+N2+S組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯下降（P<0.01）及MDA表達(dá)水平明顯上升（P<0.01）。 結(jié)論 SIRT1 參與H2S減輕Hcy導(dǎo)致的海馬氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞] SIRT1;硫化氫;同型半胱氨酸;海馬氧化應(yīng)激損傷

[中圖分類號] R745.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）36-0033-04

SIRT1 participation in hydrogen sulfide to improve homocysteine-induced hippocampal oxidative stress damage

WEI Haijun? ?WANG Yue? ?HU Ya? ?ZHAO Mei? ?WU Airong? ?ZHAO Zhonggui? ?ZHANG Qingli

Medical School， Hunan Polytechnic of Environment and Biology， Hengyang? ?421005， China

[Abstract] Objective To explore whether Silent Signal Regulator 1 （SIRT1） participates in hydrogen sulfide （H2S） to improve homocysteine （Hcy）-induced hippocampal oxidative stress damage. Methods Male SD rats were randomly divided into 9 groups， as the normal （CON） group， the Hcy （0.2 μmol） （H1） group， the Hcy （0.6 μmol） （H2） group， the Hcy （2.0 μmol） （H3） group， the Hcy （0.6 mol）+NaHS （30 μmol/kg） （H2+N1） group， the Hcy （0.6 μmol）+NaHS （100 μmol/kg） （H2+N2） group， the normal+NaHS （100 μmol/kg） （C+N2） group， the Hcy （0.6 μmol）+NaHS （100 μmol/kg）+SIRT1 inhibitor Sirtinol （10 nmol） （H2+N2+S） group， and the normal+Sirtinol （10 nmol） （C+S） group， with 10 rats in each group. Microinjection of Hcy into the lateral ventricle was used to establish the neurotoxicity model of Hcy. Two days before Hcy injection， NaHS was injected into the intraperitoneal cavity and Sirtinol was injected into the lateral ventricle to pretreat SD rats for 2 days. Then， the rats were co-treated with Hcy for 7 days.? Various kits were used to detect contents of hippocampal total antioxidant capacity （T-AOC）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in the rats. Results Compared with the CON group， the contents of hippocampal T-AOC and SOD of the H1 and H2 groups were decreased （P<0.01）， and the MDA expression levels were increased （P<0.001）. Compared with the H2 group， the contents of hippocampal T-AOC and SOD of the H2+N2 group were increased significantly （P<0.01）， and the MDA expression level was decreased significantly （P<0.01）. Compared with the H2+N2 group， the contents of hippocampal T-AOC and SOD of the H2+N2+S group was significantly decreased （P<0.01）， and the MDA expression level was significantly increased （P<0.01）. Conclusion SIRT1 participates in H2S to reduce Hcy-induced hippocampal oxidative stress damage.

[Key words] SIRT1; Hydrogen sulfide; Homocysteine; Hippocampal oxidative stress damage

同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）可引起神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[1]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Hcy可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)變性[2]。而硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是一種內(nèi)源性氣體分子，具有神經(jīng)保護(hù)作用[3]。Kang等[4]報(bào)道，H2S對Hcy導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞衰老具有抑制作用。而在學(xué)習(xí)和記憶的形成中，沉默信號調(diào)節(jié)因子1（Silent information regulator，SIRT1）是必需的。Tang等[5]發(fā)現(xiàn)，H2S可減輕Hcy引發(fā)的大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，其機(jī)制與上調(diào)SIRT1表達(dá)有關(guān)。本研究將從氧化應(yīng)激的新視角，觀察SIRT1 是否與H2S減輕Hcy導(dǎo)致的海馬氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1試劑和儀器? NaHS、Hcy及各種檢測試劑盒（Sigma公司）。微量注射泵、側(cè)腦室注射用系列套管及大鼠腦立體定位儀（美國 Stoelting 公司）。電子分析天平（日本島津公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物? 購買雄性 SD 大鼠（長沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，260～300 g），將其飼養(yǎng)1周，給予自由飲水及飲食。實(shí)驗(yàn)的操作均符合中華人民共和國國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》中的規(guī)定，并經(jīng)本單位醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3 藥品的配制? ①Hcy注射液的制備：用天平量取 0.33 645 g 固態(tài)Hcy，將其放入5 mL生理鹽水中，使其充分溶解成為0.5 μmol/μL的母液;②NaHS注射液的制備：用天平量取 100 mg 固態(tài)硫氫化鈉，將其放入1 mL雙蒸水中，使其充分溶解成為100 mg/mL的母液。將二者都保存在 -20℃ 冰箱，備用。

1.2 方法

1.2.1 動物分組? 隨機(jī)將雄性SD大鼠分成9組，即正常（CON）組、Hcy（0.2 μmol）（H1）組、Hcy（0.6 μmol）（H2）組、Hcy（2.0 μmol）（H3）組、Hcy（0.6 mol）+NaHS（30 μmol/kg）（H2+N1）組、Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）（H2+N2）組、正常+NaHS（100 μmol/kg）（C+N2）及Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+SIRT1的抑制劑Sirtinol（10 nmol）（H2+N2+S）組、正常+Sirtinol（10 nmol）（C+S）組，每組10只。

1.2.2 給藥方法&nbsp; H1、H2、H3組連續(xù)7 d側(cè)腦室給藥Hcy。確定H2組為損傷濃度后，在大鼠側(cè)腦室給藥Hcy前2 d，對其進(jìn)行腹腔注射NaHS（30 μmol/kg或100 μmol/kg），連續(xù) 9 d。確定NaHS保護(hù)組濃度為100 μmol/kg后，再用Sirtinol（10 nmol/d，icv）及NaHS （100 μmol/kg/d，ip）共同預(yù)處理 SD大鼠2 d，然后與 Hcy （0.6 μmol /d，icv）共處理7 d。

1.2.3試劑盒測定大鼠海馬中T-AOC、SOD和 MDA表達(dá)水平? 取9倍體積的 0.9%氯化鈉溶液放入各組大鼠的海馬組織中，以制備海馬組織勻漿，將其離心后取上清，并采取BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，再按相應(yīng)試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行檢測。

1.3觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察指標(biāo)：各種試劑盒測定大鼠海馬中T-AOC、SOD和 MDA表達(dá)水平。

評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：各組比較T-AOC、SOD和 MDA的含量高低，T-AOC、SOD含量降低和MDA含量越高代表氧化應(yīng)激損傷程度越嚴(yán)重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）顯示。組間比較及隨機(jī)成組設(shè)計(jì)分別用LSD-t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy可減少大鼠海馬組織中T-AOC、SOD的含量及增加MDA水平

與CON 組比較，H1、H2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降（P<0.01）及MDA表達(dá)水平升高（P<0.001），提示 Hcy可引發(fā)大鼠海馬氧化應(yīng)激損傷。見表1。

2.2 H2S 可拮抗Hcy降低大鼠海馬組織中T-AOC、SOD的含量及升高M(jìn)DA含量的作用

與H2組比較，H2+N2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯上升（P<0.01）及MDA表達(dá)水平明顯降低（P<0.01），說明H2S可減輕Hcy引發(fā)的大鼠海馬氧化應(yīng)激損傷。見表2。

2.3 Sirtinol 可逆轉(zhuǎn) H2S 對 Hcy 誘導(dǎo)大鼠海馬組織中T-AOC、SOD的含量下降及 MDA 水平增加的抑制作用

與H2+N2組比較，H2+N2+S組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯下降（P<0.01）及MDA表達(dá)水平明顯上升（P<0.01），說明Sirtinol 取消了H2S 可減輕Hcy 引發(fā)海馬氧化應(yīng)激損傷的作用，提示SIRT1 參與H2S減輕Hcy引發(fā)的海馬氧化應(yīng)激損傷。見表3。

3 討論

研究證實(shí) Hcy 可損傷PC12細(xì)胞[6]及引起動物大腦的線粒體功能障礙[7]。Kumar[8]等報(bào)道H2S 可通過增加內(nèi)源性硫化氫水平來減輕Hcy引起的神經(jīng)化學(xué)變化。此外，研究發(fā)現(xiàn)H2S可改善 Hcy 的神經(jīng)細(xì)胞毒性[9]及減弱 Hcy 誘導(dǎo)的SD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損害[10]。但是H2S的這種作用，需進(jìn)一步闡明其機(jī)制，氧化應(yīng)激是引起神經(jīng)系統(tǒng)方面疾病的一個(gè)重要因素。T-AOC含量越高代表組織總抗氧化能力越好，此外，SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性越高代表組織的抗氧化應(yīng)激能力越強(qiáng)，而MDA是一種氧化應(yīng)激中脂質(zhì)過氧化的重要中間產(chǎn)物，可反映海馬組織氧化損傷的程度[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CON 組比較，H1、H2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降及MDA含量增加，而與H2組相比，H2+N2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯上升而MDA含量明顯下降，表明硫化氫可減輕Hcy導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。SIRT1在神經(jīng)保護(hù)方面起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸依賴的NAD+耗竭會引起SIRT1的功能障礙，并進(jìn)一步可能刺激Aβ的產(chǎn)生[12]。Tang等[13]發(fā)現(xiàn)五味子酚可改善東莨菪堿所致的AD小鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制是與激活SIRT1-PCG1α信號及抑制tau蛋白的磷酸化有關(guān)。SIRT1還可調(diào)節(jié)海馬氧化應(yīng)激損傷[14]，本研究發(fā)現(xiàn)與H2+N2組比較，H2+N2+S組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降及MDA表達(dá)水平明顯上升。這說明Sirtinol 取消了H2S 可減輕Hcy引發(fā)海馬氧化應(yīng)激損傷的作用，也提示SIRT1 參與H2S減輕Hcy引發(fā)的海馬氧化應(yīng)激損傷。此外，顧依靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠H9c2心肌細(xì)胞中，用過氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型時(shí)，H2S可提高SIRT1的活性及減少M(fèi)DA的含量。賈強(qiáng)等[11]發(fā)現(xiàn)H2S可通過抑制海馬組織氧化應(yīng)激損傷來減輕糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。此外，Tabassum等[16]報(bào)道H2S可通過影響線粒體氧化應(yīng)激發(fā)揮抗氧化功能，Kang等[4]提出H2S可減輕Hcy導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞衰老，其機(jī)制與SIRT1表達(dá)有關(guān)。這提示了SIRT1在H2S抗氧化應(yīng)激損傷中的作用不可忽視，值得進(jìn)一步深入研究，以明確SIRT1的具體作用機(jī)理。

此外，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neu-rotrophic factor，BDNF）是一種神經(jīng)保護(hù)因子，研究表明H2S可減輕甲醛（Formaldehyde，F(xiàn)A）誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制是與調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)有關(guān)[17]，同時(shí)，Liu等[18]發(fā)現(xiàn)BDNF-TrkB通路介導(dǎo)了H2S在糖尿病大鼠中的抗抑郁作用，其機(jī)制是通過促進(jìn)海馬自噬，此外，F(xiàn)ahimeh等[19]報(bào)道在出生后早期的雄性幼鼠中給予酒精，會引起幼鼠的空間記憶障礙，但是H2S可通過增加BDNF水平來減輕幼鼠的空間記憶障礙。以上提示BDNF也可能在H2S改善Hcy誘導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮作用。

綜上所述，SIRT1參與了H2S改善Hcy導(dǎo)致的海馬氧化應(yīng)激損傷還需更加深入地探討，本研究為H2S拮抗Hcy神經(jīng)毒性機(jī)制的研究提供了新思路，也為探討出更多防治與Hcy相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供了新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2021-03-02）