壯腰健身丸UPLC 指紋圖譜及化學模式識別

喻何云，任琦，丁銀平，趙敏敏,2，付輝政，游媛

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

壯腰健身丸由女貞子（酒蒸）、金櫻子、千斤拔、黃精、狗脊、熟地黃、制何首烏七味藥材組成，具有壯腰健身的功效，臨床上廣泛用于腰腿酸軟，心悸眼花，耳鳴頭暈，陽萎遺精等治療［1］。壯腰健身丸現(xiàn)行標準收載于《中國藥典》2020 版一部。目前，其質量控制研究停留在HPLC 法測定特女貞苷單一成分的含量，檢測指標少，難以有效控制壯腰健身丸的整體質量。由于壯腰健身丸成分復雜多樣性，臨床用藥時需各成分相互協(xié)同才能達到治療效果，但現(xiàn)行標準難以控制產(chǎn)品質量，無法保證產(chǎn)品工藝的穩(wěn)定性與均一性。目前針對其質量分析，僅有壯腰健身丸質量標準研究［2］及微波消解-電感耦合等離子體質譜法測定壯腰健身丸中的重金屬及有害元素［3］的報道，未見國內(nèi)外有關壯腰健身丸指紋圖譜的研究報道。

中藥指紋圖譜［4-6］能夠反應中藥活性成分整體特性，具有分析速度快、專屬性強、重現(xiàn)性好等特點。化學模式識別［7-9］能夠將指紋圖譜的多維信息進行處理、綜合分析評估，全面客觀地反映中藥的整體信息，對其質量控制及質量評價研究起到重要的作用。故本研究建立了壯腰健身丸UPLC 指紋圖譜，同時進行相似度評價，并結合聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判別分析3 種化學模式識別分析方法對其進行質量評價研究［10-18］，旨在為全面控制及評價壯腰健身丸提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity（DAD）型超高效液相色譜儀（美國Agilent 科技有限公司）；Milli-Q Direct 16 超純水儀（德國Millipore 中國有限公司）；Sartorius BT 25 S 型十萬分之一天平（德國Sartorius 公司）；Sartorius BSA 124S-CW 型萬分之一天平（德國Sartorius 公司）。

1.2 試藥

紅景天苷（批號：110818-200404）；2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：110844-201109）；特女貞苷（批號：111926-201102）；染料木素（批號：111704-201703）；大黃素（批號：110756-201512）；大黃素甲醚（批號：110758-201616），以上均購自中國食品藥品檢定研究院。女貞子（酒蒸）、黃精、熟地黃、金櫻子、狗脊、制何首烏、千斤拔七味藥材均由江西九華藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)江西省藥品檢驗檢測研究院付輝政主任鑒定為正品。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他為分析純。11 批壯腰健身丸分別來自江西九華藥業(yè)有限公司（批號：190101、190102、190301、160102、160302、160603、180701、180702、180901、180902）、江西半邊天藥業(yè)有限公司（批號：20160701）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），進行梯度洗脫（0～20 min，5%～90% A；20～25 min，90% A）；檢測波長為波長轉換（0～4.1 min，320 nm；4.1～4.8 min，254 nm；4.8～7.0 min，224 nm；7.0～11.0 min，320 nm；11.0～16.0 min，254 nm；16.0～19.0 min，320 nm；19.0～25.0 min，288 nm）；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取紅景天苷對照品、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品、特女貞苷對照品、大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 各含紅景天苷15 μg、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷12 μg、特女貞苷60 μg、大黃素7 μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，剪碎，混勻，取約2 g，精密稱定，精密加80%甲醇50 mL，置具塞錐形瓶中，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 單味藥材溶液的制備 取女貞子（酒蒸）、黃精、熟地黃、金櫻子、狗脊、制何首烏、千斤拔七味藥材，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取樣品（批號：180901），按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定，記錄各色譜峰保留時間和積分峰面積。以8 號色譜峰（特女貞苷）為參照峰（S），計算各色譜峰的相對保留時間RSD＜1.00%，相對峰面積RSD＜5.00%，圖譜相互間相似度均大于0.90，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取樣品（批號：180901）6 份，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄各色譜峰保留時間和峰面積。以8 號色譜峰（特女貞苷）為參照峰（S），計算各色譜峰的相對保留時間RSD＜1.00%，相對峰面積RSD＜5.00%，圖譜相互間相似度均大于0.90，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取樣品（批號：180901）1 份，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 測定指紋圖譜，記錄各色譜峰保留時間和峰面積。以8 號色譜峰（特女貞苷）為參照峰（S），計算各色譜峰的相對保留時間RSD＜1.00%，相對峰面積RSD＜5.00%，圖譜相互間相似度均大于0.90，表明該供試品溶液至少在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立 取11 批壯腰健身丸樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄。將得到的數(shù)據(jù)導入2012 版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，選取“時間窗寬度”為0.10 min，對照圖譜的生成方法為“中位數(shù)”，自動匹配后，得到對照圖譜，見圖1，共確定15 個共有峰。

圖1 壯腰健身丸的對照指紋圖譜

2.4.2 共有峰的指認、歸屬及參照峰的選擇 取“2.2”項下的制備的3 種溶液，分別按“2.1”項下色譜條件測定，結果見圖2。采用對照品保留時間及紫外光譜圖指認出6 個特征峰，分別是4 號峰紅景天苷，6 號峰2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，8 號峰特女貞苷，12 號峰染料木素，13 號峰大黃素，15 號峰大黃素甲醚。將供試品與藥材色譜圖進行對比，歸屬了15 個共有峰，女貞子（酒蒸）提供了4、5、7、8、10 號峰；金櫻子提供了9 號峰；千斤拔提供了12、14 號峰；黃精提供了1 號峰；熟地黃提供了1、2、3、11 號峰；制何首烏提供了6、13、15 號峰。其中8 號峰為女貞子（酒蒸）的特征成分，該峰保留時間適中、吸收強、分離度好，故將其作為參照峰，見圖2。

圖2 色譜峰指認及歸屬

2.4.3 相似度評價 將11 批壯腰健身丸的數(shù)據(jù)導入2012 版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，計算樣品與對照指紋圖譜之間的相似度，結果分別為1.000、0.999、0.994、0.811、0.837、0.803、0.855、0.851、0.936、0.906、0.720。結果表明，11 批次樣品相似度有4 批次樣品低于0.850。

2.5 化學模式識別

2.5.1 聚類分析（CA）將11 批壯腰健身丸樣品的15 個共有峰的峰面積相對于稱樣量量化后進行標準化處理，組成11×15 階原始矩陣，運用IBM SPSS Statistics 23.0 軟件，以組間聯(lián)接為聚類方法，測量度采用平方歐氏距離，進行系統(tǒng)聚類分析，CA 樹狀圖見圖3。結果顯示，當歐氏距離為10 時，11批樣品可分為3 類：Ⅰ類：S1～S3，相似度均大于0.990；Ⅱ類：S4～S10 相似度均大于0.800；Ⅲ類：S11。此結果與相似度評價結果一致。

圖3 11批壯腰健身丸聚類分析結果

2.5.2 主成分分析（PCA）用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對量化的各共有峰峰面積進行標準化處理后，對11 批壯腰健身丸進行主成分分析，計算相關系數(shù)矩陣的特征值及其方差貢獻率。提取3 個主成分（特征值＞1），其累計方差貢獻率為89.915%，可代表指紋圖譜共有峰的大部分信息。利用SIMCA 14.1軟件繪制主成分散點得分圖，見圖4。結果顯示11批壯腰健身丸可分為3 類，與聚類分析結果一致。

圖4 11批壯腰健身丸主成分分析散點得分圖

2.5.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）為進一步篩選出貢獻較大的成分，本研究在主成分分析的基礎上，采用SIMCA 14.1 軟件建立OPLS-DA 模型，結果X 矩陣結實率參數(shù)R2X 為0.843，模型穩(wěn)定性參數(shù)R2Y 為1，模型預測能力參數(shù)Q2為0.869，均大于0.5，且R2和Q2兩者差距均小于0.2，說明所建模型解釋率、穩(wěn)定性和預測性均較強。經(jīng)OPLS-DA 模型擬合分析，得到11 批供試品的得分散點圖，見圖5。為驗證所建OPLS-DA 模型是否存在過度擬合，將分類矩陣變量參數(shù)設定隨機排列200 次做置換檢驗，見圖6。結果R2和Q2擬合線在Y 坐標軸的截距分別為0.129（應小于0.3）和-0.761（應小于0.05），表明該模型不存在過度擬合現(xiàn)象，結果可靠。

圖5 11批壯腰健身丸OPLS-DA得分圖

圖6 11批壯腰健身丸OPLS-DA置換檢驗圖

VIP 圖可直觀體現(xiàn)影響樣品組間差異的差異性成分，VIP＞1 即為質量差異標志性成分，見圖7。結果峰6（2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡萄糖苷）、峰3、峰2、峰8（特女貞苷）的VIP 值均大于1，為壯腰健身丸的質量差異標志性成分。建議企業(yè)在生產(chǎn)過程中，應著重關注這些成分，并建立相應的質量控制體系，以提高產(chǎn)品的均一性及穩(wěn)定性。

圖7 11批壯腰健身丸OPLS-DA VIP 圖

3 討論

3.1 色譜條件的考察

本實驗分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%醋酸溶液、乙腈-水不同比例梯度洗脫流動相系統(tǒng)，不同流速（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/min），不同柱溫（25、30、35、40、45 ℃），不同進樣量（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL）對分析結果的影響。綜合分離效果、色譜峰的峰形，采用甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脫、0.2 mL/min 流速、40 ℃柱溫、2.0 μL 進樣量的色譜條件作為壯腰健身丸指紋圖譜分析條件。

3.2 結果分析

指紋圖譜相似度評價結果表明，11 批次樣品相似度有4 批次樣品低于0.85，說明不同生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)工藝差異性較大，且同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的樣品間差異性也較大。分析原因可能與工藝（粉碎程度及消毒方式）、原藥材（質量優(yōu)劣）、投料（少投料）等因素有關。本試驗采用了CA、PCA 及OPLS-DA 3 種化學識別模式分析方法，將樣品分成了3 類，并篩選到了4 個質量差異標志性成分，分別為峰6（2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）、峰3、峰2、峰8（特女貞苷）。通過單味藥材對照實驗，最終確定6 號峰來自制何首烏，3號峰及2 號峰均來自熟地黃，8 號峰來自女貞子（酒蒸）。提示生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)制備過程中應重點關注上述4 個成分的含量變化以及原藥材制何首烏、熟地黃、女貞子（酒蒸）的質量優(yōu)劣情況。

4 結論

本試驗建立了壯腰健身丸UPLC 指紋圖譜，并結合CA、PCA 及OPLS-DA 化學模式識別技術對其質量進行綜合評價，該分析方法專屬性強、重現(xiàn)性好、分析速度快，為科學、有效、快速地控制及評價壯腰健身丸質量提供參考依據(jù)。