中藥材及中藥飲片微生物污染研究

霍曉菲，劉衛(wèi)德，劉緒平，章紅

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

目前國際上對中藥的微生物研究方面還處于起步階段。在國內(nèi)，對于中藥材加工炮制、儲(chǔ)存過程中微生物污染控制的系統(tǒng)性研究較少?，F(xiàn)今藥材和飲片的質(zhì)量控制重點(diǎn)主要在性狀、鑒別方面，相比之下，藥材和飲片微生物控制系統(tǒng)的研究及其污染來源和控制手段的研究較少。由于國際標(biāo)準(zhǔn)的限制，目前我國中藥的出口產(chǎn)品主要是精油、提取物等產(chǎn)品。而中藥飲片、中藥制劑由于“重金屬”“農(nóng)殘”“微生物污染”這三大問題，多數(shù)產(chǎn)品被拒絕于國際市場之外。尤其是微生物污染方面，國內(nèi)研究還不夠成熟，國內(nèi)和國外的標(biāo)準(zhǔn)存在差異，是其主要制約因素，一旦解決微生物污染控制的問題，將極大地推動(dòng)我國中藥邁向世界市場，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，其背后所蘊(yùn)含的長期經(jīng)濟(jì)價(jià)值無可估量。

1 中藥材及其飲片污染微生物的種類

中藥材及飲片常經(jīng)過煎、煮、泡等方法處理后給藥進(jìn)入患者體內(nèi)，而某些耐熱微生物通過煎煮和熱水沖泡后可能無法被完全殺滅，其中的致病菌和條件致病菌進(jìn)入人體后可引起腸胃道和肺部感染等疾?。?］，而且微生物的代謝產(chǎn)物（如一些毒素）依舊存在，可能還會(huì)使患者中毒，對患者身體存在潛在危害。

1.1 細(xì)菌

中藥飲片中的優(yōu)勢菌株大多為腸桿菌和芽孢桿菌，腸桿菌中存在的條件致病菌及致病菌對患者存在威脅，比如產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌等。芽孢桿菌雖對人體無害，但常規(guī)手段難以消除，藥材存在污染風(fēng)險(xiǎn)。孫鶯等［2］對中藥飲片黃芪、甘草、板藍(lán)根中微生物污染狀況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中的優(yōu)勢菌株為腸桿菌和芽孢桿菌。繩金房等［3］對陜西省12種中藥飲片微生物考察發(fā)現(xiàn)腸桿菌科微生物占首位。趙紅霞［4］對多種中藥飲片中的耐膽鹽革蘭陰性菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黨參、麥冬、丹參中的優(yōu)勢菌種分別為假結(jié)核耶爾森菌、河生腸桿菌、陰溝腸桿菌。趙紅霞［4］研究發(fā)現(xiàn)中藥飲片中存在的細(xì)菌大概二百種，優(yōu)勢菌種為腸桿菌。

1.2 真菌

藥材中的優(yōu)勢霉菌包括曲霉屬、鐮刀屬、青霉屬，這些霉菌廣泛分布于土壤、水源、空氣和農(nóng)作物中，都是常見的霉菌。劉震營等［5］研究發(fā)現(xiàn)柏子仁樣本中均存在煙曲霉和黑曲霉等潛在致病真菌。部分曲霉菌能夠產(chǎn)生毒素，藥材中常見的霉菌毒素有黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮毒素。青霉菌是薄荷、洋甘菊和鼠尾草中的優(yōu)勢菌株［6］，特別是在洋甘菊中，每個(gè)批次都檢測到了青霉菌。儲(chǔ)藏中的藥材更容易受到青霉菌污染。Yue 等［7］研究7種藥材的霉菌污染情況，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌是污染率最高的，82%的樣品污染了該菌。張秋實(shí)等［8］研究發(fā)現(xiàn)全部中藥飲片樣品的霉菌污染率為97.6 %，其中曲霉屬占85.7%，青霉屬占29.6%，98 份含有黃曲霉毒素。同樣國外也存在真菌污染情況，Katere等［9］在分析的16 批中藥材樣本中發(fā)現(xiàn) 15 批樣品被曲霉、鐮刀菌和青霉菌這三個(gè)真菌屬中的至少一個(gè)污染。

2 導(dǎo)致微生物侵染的主要因素

中藥飲片源于自然的植物、動(dòng)物、礦物及昆蟲等，藥材本身的形態(tài)基質(zhì)、生長環(huán)境、種植技術(shù)、采收加工及運(yùn)輸存儲(chǔ)等過程中都容易攜帶或引入大量微生物，影響中藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性。

2.1 藥材自身基質(zhì)及形態(tài)

藥材自身的含水量、營養(yǎng)物質(zhì)，表面積及表面形態(tài)等因素均會(huì)影響其微生物污染。劉洪祥等［10］研究發(fā)現(xiàn)艾葉的表面積比較大，因此該藥材上存留的微生物較多；甘松的根莖入藥，藥材和土壤接觸，且飲片為須根狀，易附著殘留微生物。枸杞內(nèi)有豐富的枸杞多糖，藥材表皮為褶皺狀，易造成微生物的殘留。富含糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的藥材能夠給微生物提供生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)，因此受到微生物的污染更嚴(yán)重。比如黨參、柏子仁、人參、核桃仁、甘草、葛根、川牛膝以及玉竹等富含淀粉和黏液的藥材都很容易霉變。植物類藥材相比礦物類藥材受霉菌污染嚴(yán)重［11］。

2.2 生長環(huán)境

大量研究表明，微生物在空氣、水源、土壤中廣泛生存，能夠?qū)χ兴幉脑斐晌⑸镂廴?，氣候條件也會(huì)影響藥材的微生物負(fù)載，其中耐熱菌主要來源于土壤環(huán)境，藥材的土壤殘留與耐熱菌檢出率密切相關(guān)，耐膽鹽革蘭陰性菌主要是藥材種植過程中因施加糞肥造成的微生物污染［12-13］。

2.3 種植技術(shù)

種植技術(shù)不當(dāng)或連年在一塊土地上種植同一種藥材會(huì)影響土壤中的霉菌體系，引起或加重藥材微生物負(fù)載。合理地耕作也是控制藥材微生物負(fù)載的有效方法。通過埋藏植物殘?bào)w能明顯降低土壤中微生物的種類及數(shù)量，進(jìn)而降低作物受微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。鄧彥等［12］在研究發(fā)現(xiàn)藥材種植可能是影響耐膽鹽革蘭陰性菌污染水平的主要因素之一。

2.4 采收

中藥材的質(zhì)量和安全與采收有著密不可分的聯(lián)系。例如延遲采收會(huì)增加黃曲霉菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，對原藥材進(jìn)行機(jī)械性的破壞或擠壓,可能會(huì)導(dǎo)致藥材的腐爛或變質(zhì)。張西梅等［14］研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁上黃曲霉毒素負(fù)載重要原因是采收加工環(huán)境中的黃曲霉污染。

2.5 炮制加工

炮制方法影響中藥飲片的微生物負(fù)載情況，經(jīng)過熱處理（炒制、煮制等）的炮制方法能降低飲片的微生物負(fù)載，但是藥材不加熱的炮制和輔料的加入會(huì)加重飲片的微生物負(fù)載。張平等［15］對五十種中藥飲片微生物負(fù)載情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同炮制方法會(huì)影響微生物的負(fù)載，煮制和炒制檢出微生物最少，切制最多。甘永琦等［16］研究廣西地區(qū)九種中藥飲片微生物負(fù)載情況，發(fā)現(xiàn)熱加工炮制（炙制、炒制、蒸制）的飲片微生物負(fù)載水平和不加熱的粉碎、切制、凈制的飲片微生物負(fù)載水平存在較大差異。

2.6 貯藏條件

貯藏條件不合適會(huì)加重藥材的微生物負(fù)載，影響中藥質(zhì)量和療效，有些致病菌會(huì)產(chǎn)生有害毒素例如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等，影響患者的用藥安全性。例如檢驗(yàn)中存在土鱉蟲、柏子仁等黃曲霉毒素超標(biāo)的現(xiàn)象。中藥材經(jīng)過采收和加工處理后要經(jīng)歷數(shù)月到數(shù)年的貯存，因此如何保證貯藏?cái)?shù)月甚至數(shù)年的中藥材的質(zhì)量安全，需要進(jìn)一步研究貯藏條件，制定相關(guān)技術(shù)規(guī)范［17］。

3 控制方法

3.1 貯藏前的控制

貯藏前控制是指在藥材貯藏前的種植、采收、加工過程中減少微生物污染。如不使用糞肥，進(jìn)行輪種，采收后的藥材及時(shí)清理掉中藥材表面的微生物，保證藥品在貯藏期內(nèi)的質(zhì)量，減少微生物侵染的機(jī)會(huì)。

3.1.1 種植 用于種植的中藥材料應(yīng)在保證品質(zhì)的基礎(chǔ)上確保其沒有受到病蟲侵害和微生物的污染。另外進(jìn)行繁殖的中藥材應(yīng)能耐受生物因素。不能使用人類的糞便作為肥料；要將動(dòng)物糞便充分腐熟，使其中的微生物負(fù)載水平達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn)再作為肥料；應(yīng)使用國家認(rèn)可批準(zhǔn)的化肥；不在同一片土地上連年種植同一種植物,輪種可以控制植物中霉菌的生長；對于發(fā)酵的中藥材例如曲類和豆豉類等，將自然發(fā)酵生產(chǎn)改成純種發(fā)酵，可以有效控制產(chǎn)毒致病菌的污染［18］。

3.1.2 采收 藥材采收時(shí)應(yīng)根據(jù)藥典標(biāo)準(zhǔn)的最佳采收季節(jié)及時(shí)收割［19］，采收時(shí)盡量避免露水、雨天以及高濕等潮濕環(huán)境。采收后要及時(shí)進(jìn)行干燥。收割機(jī)以及采收使用的容器應(yīng)保持干凈和干燥且未受到前次采收藥材的污染。不用時(shí),應(yīng)將這些容器保存在干燥干凈無污染的場所中。

3.1.3 認(rèn)真清除中藥材表面附著的微生物 采收后的藥材應(yīng)采用機(jī)器視覺技術(shù)［20］進(jìn)行分揀，去除腐爛、有損傷的藥材，過程中盡量避免和土壤接觸。中藥材表面負(fù)載的微生物，是藥材貯藏過程中發(fā)霉腐爛的主要原因之一,部分中成藥中的微生物也源于中藥材表面負(fù)載的微生物。所以在凈制環(huán)節(jié)要加強(qiáng)清洗，有效降低藥材微生物污染種類和污染水平。同時(shí)要考慮藥材所含有效成分的性質(zhì)，選擇合適的清洗方法，例如水洗的壓力、時(shí)間、溫度及水量等，可以對凈制前后藥材的微生物負(fù)載情況及含量進(jìn)行對比，從而找到適合的凈制方法［21］。

3.2 貯藏過程中的控制

貯存條件應(yīng)干燥潔凈無污染，并且鳥、畜禽及蟲無法接觸到該藥材。貯藏過程中消滅藥材上負(fù)載的微生物或使其無法在藥材上生長是控制微生物污染的最根本方法。因此,貯藏過程是控制微生物負(fù)載的關(guān)鍵步驟,可從以下幾個(gè)方面展開。

3.2.1 控制溫度和濕度 降低溫度不僅可以抑制微生物的繁殖,還能夠避免部分真菌毒素的產(chǎn)生，中藥材中主要是中溫型微生物，在15 ℃就可以生長繁殖,其最適合生長的溫度是20～40 ℃。所以，高溫季節(jié)需保證低溫貯藏,另外少數(shù)的耐低溫微生物，可以控制藥材的水分和環(huán)境干燥度來控制其生長。研究發(fā)現(xiàn)，如果藥材的含水量低于10%，貯藏溫度低于13 ℃，相對濕度低于70%,能夠有效控制中藥材中的微生物生長繁殖［22］。

3.2.2 物理養(yǎng)護(hù) 現(xiàn)在物理養(yǎng)護(hù)技術(shù)已經(jīng)十分成熟，現(xiàn)代輻射技術(shù)（18 000 Gy 劑量的60 Co-Y 射線［23］）、聚乙烯薄膜密封包裝與Co-Y 射線輻照（≤7 000 Gy）相結(jié)合的工藝、微波處理等，能夠有效延長中藥材的貯藏期。現(xiàn)在最受推廣的物理養(yǎng)護(hù)方法為氣調(diào)養(yǎng)護(hù)，它可以制造一個(gè)低氧與高一氧化碳的環(huán)境，這種環(huán)境通過抑制藥材自身呼吸和微生物的生長繁殖來防止藥材的質(zhì)變［23］。

3.2.3 化學(xué)養(yǎng)護(hù) 貯藏地點(diǎn)應(yīng)用硫黃、環(huán)氧乙烷［24］等進(jìn)行化學(xué)養(yǎng)護(hù)，可以有效防止霉菌生長，磷化鋁片放入藥材中，能夠消滅昆蟲間接降低霉菌負(fù)載。二甲基甲酰胺能夠控制黃曲霉、黑曲霉、青霉等30多種霉菌的生長繁殖，成本低且安全高效。

3.2.4 生物抑制 生物競爭的方法已應(yīng)用于水稻、玉米等農(nóng)作物防霉，該方法可以進(jìn)一步開發(fā)用于抑制藥材中霉菌的生長繁殖。解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶可通過改變黃曲霉細(xì)胞的通透性、滲入細(xì)胞質(zhì)、破壞細(xì)胞器來影響真菌生長和黃曲霉毒素的產(chǎn)生［25］。由萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）分泌的拮抗蛋白也可以通過此方式發(fā)揮抑菌作用,可誘使黃曲霉菌絲發(fā)生變異［26］。屈璐璐［27］研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能有效抑制稻谷中霉菌數(shù)的增長，可用于防控稻谷黃曲霉及其毒素的污染。某些微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物具有覆蓋廣、見效快等特點(diǎn),近年來也常被用來控制真菌病原體。

4 討論

由于中藥材多源于天然植物、動(dòng)物和礦物，其因?yàn)樽陨砘|(zhì)和形態(tài)可能帶有大量的微生物負(fù)載,如根莖類藥材帶有土壤中的微生物負(fù)載較多;葉、花、果實(shí)類藥材常帶有空氣中的各類微生物。中藥材及其飲片在其種植、采收、加工和貯藏過程中還會(huì)有微生物污染，若貯存不當(dāng)還可能造成微生物侵染。中藥材及飲片中可能存在大腸埃希菌、沙門菌、志賀氏菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、白色念珠菌等多種致病菌，具有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。從種植、采收、加工、貯藏及食用方式等方面降低甚至消除微生物污染，對改善中藥材和中藥飲片質(zhì)量具有重要意義。使其符合國際標(biāo)準(zhǔn)，提高我國道地藥材的國際競爭力，推動(dòng)我國中草藥以嶄新的面貌走向國際舞臺(tái)。