Molisch反應(yīng)：發(fā)現(xiàn)、原理及應(yīng)用

郝志友，陳輝，曹彥剛，孫彥君，李紅偉，鄭曉珂，馮衛(wèi)生

河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046

Molisch反應(yīng)由Hans Molisch發(fā)現(xiàn)，又叫α-萘酚-濃硫酸反應(yīng)、莫立許反應(yīng)等，是一個(gè)重要的鑒別糖和苷類化合物的化學(xué)反應(yīng)。由于其反應(yīng)簡便、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，在糖和苷類研究歷史中起到了極大的作用。然而，也許是囿于篇幅限制，在生物化學(xué)、藥物化學(xué)、中藥化學(xué)、天然藥物化學(xué)、食品化學(xué)等相關(guān)專業(yè)課程的教材中，只是對(duì)Molisch反應(yīng)原理做粗略介紹，甚至不做介紹，更遑論其發(fā)現(xiàn)過程及其拓展應(yīng)用。本文根據(jù)原始文獻(xiàn)，對(duì)Hans Molisch的學(xué)術(shù)經(jīng)歷，Molisch反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)、原理及應(yīng)用進(jìn)行回顧，供相關(guān)教師在課堂上參考應(yīng)用，以提高相關(guān)專業(yè)大學(xué)生對(duì)該知識(shí)點(diǎn)的學(xué)習(xí)興趣，拓展其知識(shí)范圍，并期望今后該反應(yīng)在糖的定量研究上起到更大的作用。

1 Hans Molisch簡介

漢斯·莫立許(Hans Molisch，1856-1937)[1,2]生于捷克布隆(Brünn，今捷克布爾諾)，是一位苗圃主人的兒子，兒時(shí)幫助他的父親進(jìn)行苗圃種植工作，為他成為一個(gè)著名的植物生理學(xué)家培養(yǎng)了濃厚的興趣。1897年，他開啟了他的熱帶植物學(xué)之旅，并在印度尼西亞茂物進(jìn)行了一段時(shí)間的植物生理學(xué)研究，后經(jīng)由中國、日本、美國返回捷克布拉格。1909年，被任命為維也納大學(xué)植物生理學(xué)系主任，直到1928年，退休后他被任命為名譽(yù)教授。在此期間，他接到邀請(qǐng)，擔(dān)任日本東北大學(xué)新成立的生物研究所的負(fù)責(zé)人三年，隨后他到加爾各答玻色研究所(Bose Institute)講課和工作，這些均廣泛地?cái)U(kuò)展了他的研究領(lǐng)域。

Molisch研究領(lǐng)域非常廣泛，除在植物生理學(xué)研究領(lǐng)域著述頗豐外，還在植物生物學(xué)、生物化學(xué)、植物微化學(xué)等方面頗有建樹。他分離得到許多種類的紫色光合細(xì)菌，包括莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)，促進(jìn)了他細(xì)菌光合作用的研究發(fā)現(xiàn)。他對(duì)植物學(xué)和化學(xué)的出色研究使他能夠?qū)砷T學(xué)科結(jié)合，而提出了植物化感作用(allelopathy)的概念，他是植物化感作用研究的開拓者，現(xiàn)在已發(fā)展成為獨(dú)立學(xué)科。

2 Molisch反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)

人們很早就認(rèn)識(shí)到，糖類物質(zhì)深度參與了植物的生理、生化過程，是一類及其重要的化合物。因此，就需要研究者用較敏銳的方法檢識(shí)微量糖類物質(zhì)是否存在。在Molisch的時(shí)代，糖類物質(zhì)的鑒定反應(yīng)包括Trommer反應(yīng)[3]、Fehling反應(yīng)[3]等。然而，這些反應(yīng)的靈敏度不高、專屬性不強(qiáng)，因此鑒定糖類化合物的準(zhǔn)確度差。

1886年，Molisch在對(duì)植物生理學(xué)的研究過程中，偶然發(fā)現(xiàn)了一種非常靈敏的檢測(cè)糖或者苷是否存在的反應(yīng)[4]。在試管中，將約0.5-1 mL的待測(cè)溶液滴入兩滴15%-20%的α-萘酚的乙醇溶液，搖勻，隨后倒入兩倍體積的濃硫酸并迅速振搖，此時(shí)如果待測(cè)溶液中有糖的存在，則溶液迅速呈現(xiàn)紫色。隨后用水稀釋可使紫色物質(zhì)沉淀，該沉淀物可溶于氫氧化鉀溶液、乙醇、乙醚和氨水中。Molisch發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)不針對(duì)特定類型的糖，蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖均發(fā)生了顯色反應(yīng)。多元醇類物質(zhì)，包括肌醇、甘露醇、衛(wèi)矛醇和櫟醇則不發(fā)生顯色反應(yīng)。

Molisch發(fā)現(xiàn)，不僅對(duì)糖類化合物可以發(fā)生上述反應(yīng)，對(duì)于糖苷類化合物，以上反應(yīng)也可以立即或在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。因此，如果在上述條件下用任何液體獲得了紫色物質(zhì)，則應(yīng)推斷以上待測(cè)溶液中含糖，或糖苷類化合物在濃硫酸作用下反應(yīng)生成了糖。

Molisch測(cè)試了許多其他類型的有機(jī)物，包括酒精、有機(jī)酸、脂肪、苯烴、酚類、樹脂、生物堿、蛋白質(zhì)等，均對(duì)此反應(yīng)呈陰性。因此該方法對(duì)檢出糖和苷的存在具有很好的排他性。

該反應(yīng)靈敏度極高，無需加熱即可輕松檢測(cè)到0.00001%的糖，靈敏度遠(yuǎn)超Trommer和Fehling試驗(yàn)。

此外，當(dāng)時(shí)的人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，糖(葡萄糖)是健康人尿液的組成成分，糖尿病人尿液中糖的含量遠(yuǎn)超正常狀態(tài)，而其時(shí)檢測(cè)尿液中糖含量是否偏離正常狀態(tài)的檢測(cè)方法不夠靈敏。Molisch天才的想法解決了該問題。其將正常尿液和待測(cè)尿液用水稀釋至其體積的100倍，均用上述方法反應(yīng)，如果待測(cè)尿液反應(yīng)后出現(xiàn)的紫色要比正常尿液深的多，則視其為糖尿病尿?；蛘?，將正常尿液和待測(cè)尿液稀釋至其體積的400-600倍，如果是糖尿病人的尿液，即使稀釋到如此大的程度，仍能明顯地產(chǎn)生以上反應(yīng)現(xiàn)象，而正常尿液則無明顯顯色。以上半定量的方法為當(dāng)時(shí)人們?cè)\斷糖尿病提供了很好的工具。

從此以后，該反應(yīng)被廣為人知，在植物、動(dòng)物、真菌中糖或苷類化合物的定性鑒別中被廣泛應(yīng)用[5]，并根據(jù)它的發(fā)明者命名，被稱作莫立許反應(yīng)(Molisch’s Reaction，Molisch’s Test)。隨著該反應(yīng)的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)該反應(yīng)過程進(jìn)行了改進(jìn)，現(xiàn)在一般反應(yīng)方法如下：待測(cè)溶液約1-2 mL加入試管，滴入2-3滴5%的α-萘酚乙醇溶液，搖勻，沿試管壁緩慢加入1-2 mL濃硫酸，勿振搖。因濃硫酸較重，因此沉入試管底，上層為待測(cè)液。如果待測(cè)溶液中含有糖或苷類化合物，則在濃硫酸層和待測(cè)液層的交界處，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)紫色的環(huán)，因此該反應(yīng)也稱“紫環(huán)反應(yīng)”(反應(yīng)流程如圖1)。

圖1 Molisch反應(yīng)操作流程示意圖

3 Molisch反應(yīng)的原理

Bredereck研究了Molisch反應(yīng)的原理[6,7]，認(rèn)為單糖首先在濃硫酸作用下脫水縮合生成5-羥甲基糠醛(由己糖生成)或糠醛(由戊糖生成)，又在濃硫酸作用下，和兩分子α-萘酚縮合生成了化合物1，化合物1迅速在濃硫酸作用下，氧化生成化合物2和3而顯色。反應(yīng)過程如圖2。

圖2 Bredereck的Molisch反應(yīng)原理

但Mutsuko Ohta等[8]對(duì)以上推測(cè)的結(jié)果表示懷疑，他們認(rèn)為沒有直接的證據(jù)表明這些結(jié)構(gòu)的存在。由于磺化產(chǎn)物的形成，對(duì)Molisch反應(yīng)產(chǎn)物在結(jié)晶狀態(tài)分離幾乎不可能。在濃硫酸存在下，α-萘酚極易在C-2位(然后在C-4位)磺化?；腔磻?yīng)使反應(yīng)產(chǎn)物從反應(yīng)體系中分離，或者反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)晶，都變得困難。因此使用衍生化物反應(yīng)會(huì)改善這種情況。Mutsuko Ohta等發(fā)現(xiàn)，用2-甲基-α-萘酚代替α-萘酚和己糖、戊糖反應(yīng)一樣靈敏，且其有色反應(yīng)產(chǎn)物易于結(jié)晶，因此可用以推測(cè)Molisch反應(yīng)的機(jī)理。其用葡萄糖或5-羥甲基糠醛和2-甲基-α-萘酚、濃硫酸反應(yīng)后，反應(yīng)體系用乙酸乙酯萃取，萃取物用硅膠柱色譜分離，均得到化合物4；用鼠李糖或5-甲基糠醛與2-甲基-α-萘酚、濃硫酸反應(yīng)后，反應(yīng)體系用乙酸乙酯萃取后，用硅膠柱色譜分離，均得到化合物5。將4、5的紫外光譜和反應(yīng)混合液的紫外光譜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)混合液和產(chǎn)物的紫外光譜最大吸收所在波長相同，因此推測(cè)這兩個(gè)化合物是反應(yīng)體系特征性顯色的原因。反應(yīng)過程如圖3所示。

圖3 Mutsuko Ohta等的Molisch反應(yīng)原理

從以上實(shí)驗(yàn)過程可以看出，該方法的缺點(diǎn)是只考慮到了反應(yīng)產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物，而未考慮反應(yīng)體系中的水溶性成分。因此，隨著混合物分離技術(shù)及波譜解析技術(shù)的進(jìn)步，Molisch反應(yīng)機(jī)理仍值得進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 Molisch反應(yīng)的應(yīng)用

毋庸置疑，自從Molisch發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)后，由于其敏銳的反應(yīng)特點(diǎn)，很快廣泛應(yīng)用于各種有關(guān)糖和苷的定性研究中。雖然Molisch反應(yīng)發(fā)現(xiàn)時(shí)就進(jìn)行過半定量的實(shí)驗(yàn)，以區(qū)別正常尿液和糖尿病尿[4]，但很長時(shí)間以來其定量分析的功能被忽略了。然而，經(jīng)過對(duì)實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)，確有部分研究者將此反應(yīng)用在糖類物質(zhì)定量分析的嘗試上。

Devor A. W.[9,10]對(duì)Molisch反應(yīng)進(jìn)行改進(jìn)，以使其更適合于進(jìn)行糖的比色定量分析。在正常的Molisch反應(yīng)中，也包含了α-萘酚和濃硫酸的反應(yīng)，因此Molisch反應(yīng)的有色縮合物中除了包含糠醛衍生物外，還包含一系列的α-萘酚磺化物，這些磺化物的紫外吸收可能干擾比色結(jié)果。因此，Devor A. W.用預(yù)先磺化的α-萘酚代替正常Molisch反應(yīng)中的α-萘酚，進(jìn)行反應(yīng)后比色測(cè)定，以消除Molisch反應(yīng)過程中試劑濃度、溫度、加熱時(shí)間等的干擾，獲得更具重復(fù)性的結(jié)果。Troelsen J. E.[11]用類似的方法測(cè)定羊的飼料和糞便中葡萄糖和木糖含量，確定了飼料的可消化性。

張志華等[12]將一定量的葡萄糖溶液和濃硫酸混勻，70 °C水浴反應(yīng)15 min (產(chǎn)生糠醛衍生物)，放至室溫后加一定量的α-萘酚，搖勻放置10 min (產(chǎn)生有色物質(zhì))，加無水乙醇稀釋至10 mL，稀釋至不同濃度，在570 nm處測(cè)定吸光度，繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明在葡萄糖濃度在在1-50 × 10-6g·mL-1之間線性關(guān)系良好，可以用于含量測(cè)定，并測(cè)定了木糖醇中還原糖的含量。李勇等[13]的發(fā)明專利公開文件中也介紹了一種用類似方法測(cè)定木糖醇中還原糖的方法。洪陵成[14]的發(fā)明專利公開文件中，介紹了一種水中糖含量的比色檢測(cè)方法，也是用Molish反應(yīng)后比色的方法進(jìn)行。楊同香等[15]用Molisch反應(yīng)后比色的方法建立了一種測(cè)定糖廠汽凝水蔗糖含量的方法。李繼民等[16]建立了α-萘酚-濃硫酸分光光度法快速測(cè)定不同廠家復(fù)印紙水解液中還原糖含量的方法，為基層民警提供了快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的紙張物證的鑒定方法。

鄭敏燕等[17]建立了一種以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，通過α-萘酚-硫酸顯色、吸光光度法測(cè)定多糖含量的方法，用于測(cè)定白果多糖的含量。結(jié)果顯示，溶液最大吸收波長569 nm，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液在0.57-11.5 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度之間具有良好的線性關(guān)系，與苯酚-硫酸法相比較，測(cè)量結(jié)果基本一致。張世仙等[18]用類似方法測(cè)定酒糟多糖的含量，顯示在6-36 μg·mL-1范圍內(nèi)吸光度與被測(cè)物含量呈良好的線性關(guān)系，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

5 結(jié)語

Molisch反應(yīng)發(fā)現(xiàn)一百多年來，在相關(guān)領(lǐng)域有關(guān)糖和苷類化合物的定性研究中起到不可磨滅的作用。其反應(yīng)機(jī)理研究由于年代較早，在很大程度上屬于反應(yīng)過程的推測(cè)，因此值得更進(jìn)一步厘清，且進(jìn)一步反應(yīng)機(jī)理的研究需同時(shí)考慮反應(yīng)體系中的脂溶性和水溶性反應(yīng)產(chǎn)物。此外，以往該反應(yīng)較少用在糖或苷類物質(zhì)的定量分析上，但根據(jù)已有的文獻(xiàn)，該反應(yīng)在定量分析上極有前景，因此相關(guān)研究者值得在這方面給予更多關(guān)注。