染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白Smc5/6復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能*

廖桂艷，金 城,2，汪 斌**

(1.廣西科學(xué)院,生物科學(xué)與技術(shù)研究中心，廣西南寧 530007； 2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101)

0 引言

染色體攜帶了生物體的遺傳信息，并在細(xì)胞中代代相傳，保證了各個(gè)物種的遺傳穩(wěn)定性。在細(xì)胞的分裂過(guò)程中染色體必須被正確地拷貝和精確地分配，同時(shí)修復(fù)存在的DNA損傷，確保新的細(xì)胞中含有與親代細(xì)胞相同的遺傳信息。在人體的1×1014個(gè)細(xì)胞中每天都發(fā)生數(shù)千個(gè)DNA損傷，這些損傷可能源于代謝副產(chǎn)品活性氧族引起的損傷或DNA復(fù)制過(guò)程中的失誤，也可能源于紫外線(UV)照射、電離輻射(Ionizing Radiation,IR)或化學(xué)物質(zhì)等外界因素[1]。這些DNA損傷都有導(dǎo)致基因突變的潛在可能，而未修復(fù)的基因突變可能通過(guò)RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)影響細(xì)胞的功能，并遺傳給子代細(xì)胞，引起細(xì)胞衰老、凋亡和癌變等。 DNA損傷修復(fù)機(jī)制已成為遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白(Structure Maintenance of Chromosome,Smc)在維持染色體結(jié)構(gòu)及DNA損傷修復(fù)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Smc蛋白家族包括3類(lèi)：黏連蛋白(Cohesin)，凝縮蛋白(Condesin)和Smc5/6復(fù)合體(Smc5/6 complex)。黏連蛋白主要在細(xì)胞分裂前期發(fā)揮作用，將新復(fù)制的兩條姐妹染色單體聚集在一起，促進(jìn)姐妹染色單體的重組；凝縮蛋白主要參與細(xì)胞分裂中期染色體的凝縮過(guò)程；Smc5/6復(fù)合體在細(xì)胞周期的調(diào)控、有絲分裂和減數(shù)分裂的DNA損傷修復(fù)、維持基因組的穩(wěn)定性方面都具有重要的調(diào)控作用[2-4]。目前對(duì)黏連蛋白和凝縮蛋白的功能研究比較深入，而對(duì)Smc5/6復(fù)合體的功能和分子機(jī)理研究相對(duì)較少。因此，深入研究Smc5/6復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和各亞基的功能，對(duì)進(jìn)一步理解DNA損傷修復(fù)機(jī)制及基因組穩(wěn)定性的分子機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。本文綜述了近年來(lái)對(duì)Smc5/6復(fù)合體的研究進(jìn)展，從Smc5/6復(fù)合體的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能兩個(gè)方面進(jìn)行闡述。

1 Smc5/6復(fù)合體的結(jié)構(gòu)特征

1.1 Smc5/6復(fù)合體的組件蛋白

Smc5/6復(fù)合體首次被發(fā)現(xiàn)是在裂殖酵母中鑒定到的具有Smc蛋白結(jié)構(gòu)的Rad18和Spr18的異質(zhì)二聚體[5]。Smc5/6蛋白復(fù)合體由兩個(gè)Smc蛋白(Smc5和Smc6)異二聚體及非Smc蛋白亞基共同組成，其中在酵母、擬南芥和人體細(xì)胞中已有6個(gè)非Smc亞基(Nse1-6)被鑒定出來(lái)[6-9]。Smc蛋白是由1 000-1 300個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，在N-端和C-端分別有一個(gè)球狀的結(jié)構(gòu)域，而在Smc蛋白中間含有一個(gè)鉸鏈(Hinge)結(jié)構(gòu)域。N-端和C-端的球狀結(jié)構(gòu)域由中間的鉸鏈結(jié)構(gòu)域以反向平行的相互作用方式聚集在一起，產(chǎn)生一個(gè)具有ATP酶活性的球狀頭部(Heads)結(jié)構(gòu)域[10,11]。Smc5和Smc6蛋白在不同物種之間相對(duì)保守，具有相似的Smc蛋白結(jié)構(gòu)特征。由于Nse1的C-端含有一個(gè)Ring-like結(jié)構(gòu)域，因此推測(cè)Nse1可能具有泛素化蛋白酶的特性。研究發(fā)現(xiàn)Nse1單獨(dú)作用時(shí)并不具有泛素化蛋白酶活性，但有Nse3同時(shí)存在時(shí)表現(xiàn)出微弱的泛素化蛋白酶活性[12]。Nse2/Mms21最初在出芽酵母中通過(guò)遺傳篩選鑒定得到[13]，Nse2/Mms21的C-端也包含一個(gè)Ring 結(jié)構(gòu)域，賦予了Nse2/Mms21的SUMO連接酶活性[14,15]。Nse3的C端含有一個(gè)mage功能域，研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合特性，nse3基因在真菌及植物中是單拷貝，但是在人體細(xì)胞中與具有多拷貝的黑色素瘤抗原基因(mage)有很高的相似度，研究發(fā)現(xiàn)人體細(xì)胞中只有Mage-G1蛋白能與Smc5/6復(fù)合體發(fā)生免疫共沉淀[16-18]。Nse4是具有螺旋翼狀域的結(jié)構(gòu)蛋白，是Smc5/6復(fù)合體的必需蛋白，作為橋梁結(jié)合到Smc蛋白上穩(wěn)定復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，在維持整個(gè)復(fù)合體的穩(wěn)定性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。Nse5和 Nse6蛋白是Smc5/6復(fù)合體的非保守部分，目前僅在酵母、擬南芥和人體細(xì)胞鑒定到。

1.2 Smc5/6復(fù)合體的結(jié)構(gòu)特征

整個(gè)Smc5/6蛋白復(fù)合體由3個(gè)亞復(fù)合體(Smc5-Smc6-Nse2、Nse1-Nse3-Nse4、Nse5-Nse6)按照特定的形式組合而成[19-21](圖1)。Smc5-Smc6-Nse2亞復(fù)合體是整個(gè)Smc5/6復(fù)合體的核心組件，構(gòu)成了整個(gè)復(fù)合體的支架。Smc5和Smc6兩個(gè)蛋白通過(guò)其鉸鏈結(jié)構(gòu)域相互作用形成異二聚體(Smc5-Smc6)，Nse2/Mms21通過(guò)其N(xiāo)-末端與Smc5的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成Smc5-Smc6-Nse2亞復(fù)合體[14,22]。Nse1、Nse3和Nse4形成的Nse1-Nse3-Nse4亞復(fù)合體具有高度的保守性，結(jié)合在Smc5和Smc6的球狀頭部結(jié)構(gòu)域和DNA分子，該三聚體的穩(wěn)定性對(duì)于Smc5/6復(fù)合體在指定的DNA損傷位點(diǎn)聚集是必需的。Nse1通過(guò)Ring-like 結(jié)構(gòu)域與Nse3的N-端相互作用增加其對(duì)雙鏈DNA的結(jié)合作用[23]。Nse3的C-端與Nse4直接相互作用進(jìn)一步形成異源三聚體Nse1-Nse3-Nse4[24]。Nse4一方面與Nse3結(jié)合形成Nse1-Nse3-Nse4異源三聚體，另一方面與Smc5和Smc6的頭部相結(jié)合使得Smc5/6復(fù)合體形成一個(gè)封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[19]。Nse5-Nse6二聚體在不同的生物體中具有較大差異。Nse5和Nse6在裂殖酵母中以二聚體的形式結(jié)合在Smc5/6復(fù)合物的球形頭部區(qū)域附近，在芽殖酵母中Nse5和Nse6與Smc5/6的鉸鏈區(qū)相互作用，而在擬南芥和人體細(xì)胞中這兩個(gè)蛋白的定位還未知[8,20,25]。近期Taschner等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在芽殖酵母中Nse5-Nse6二聚體具有頭部和鉸鏈區(qū)兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)抑制Smc5/6復(fù)合體的ATP水解酶活性，對(duì)Smc5/6復(fù)合體結(jié)合DNA底物具有重要的調(diào)控作用。

2 Smc5/6復(fù)合體的生物學(xué)功能研究

對(duì)Smc5/6復(fù)合體的生物學(xué)功能研究相對(duì)較少，近年來(lái)在真菌、動(dòng)物和植物等模式生物中的研究發(fā)現(xiàn)，Smc5/6復(fù)合體在DNA損傷修復(fù)、緩解復(fù)制壓力、維持端粒長(zhǎng)度、維持細(xì)胞的正常分裂和分化等方面具有重要作用[27]。

Smc5/6由Smc5、Smc6和非Smc亞基構(gòu)成，其中Nse1、Nse2 (Mms21)、Nse3 (Mage-G1)和Nse4 4個(gè)亞基在真核生物中高度保守，而Nse5和Nse6在序列上不保守，目前僅在酵母、擬南芥和人體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)

2.1 參與DNA損傷修復(fù)

細(xì)胞由于外界環(huán)境或自身因素的影響會(huì)導(dǎo)致各種DNA損傷，其中DNA雙鏈斷裂(Double Stand Break,DSB)是一種嚴(yán)重的DNA損傷，機(jī)體中未能修復(fù)的DSB將嚴(yán)重影響個(gè)體的生長(zhǎng)和發(fā)育。在細(xì)胞中主要存在兩種DSB修復(fù)途徑：非同源重組末端連接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)和同源重組修復(fù)(Homologous Recombination,HR)。NHEJ主要在細(xì)胞有絲分裂G1期發(fā)揮作用，直接對(duì)斷裂部位通過(guò)末端連接的方式完成DSB的修復(fù)。HR主要發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂G2/S期，利用染色體為模板以同源重組的方式完成DSB的修復(fù)，這是細(xì)胞中最精確的DNA修復(fù)途徑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Smc5/6復(fù)合體在DNA同源重組修復(fù)方面發(fā)揮重要作用，在裂殖酵母S.pombe中nse1基因缺失導(dǎo)致對(duì)由電離輻射(IR)、紫外線(UV)和甲基磺酸甲酯(MMS)引起的DNA損傷修復(fù)缺陷[12,28]，裂殖酵母中Smc5/6能與同源重組關(guān)鍵蛋白R(shí)ad51/Rhp51相互作用，表明Smc5/6在同源重組修復(fù)中具有重要的作用[8,29]。在釀酒酵母S.cerevisiae有絲分裂G2期，Smc5/6通過(guò)影響Rad50/Mre11聚集在DSB損傷位點(diǎn)來(lái)影響姐妹染色單體重組完成DSB的修復(fù)[30,31]。在出芽酵母中，Smc5/6蛋白復(fù)合體能直接與RecQ解螺旋酶Sgs1結(jié)合，進(jìn)而引導(dǎo)Sgs1定位于DNA損傷位點(diǎn)，形成STR復(fù)合體(Sgs1-Top3-Rmi1)，該復(fù)合體在DSB同源重組修復(fù)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[32,33]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Smc5/6復(fù)合體不僅在真菌中，而且在動(dòng)物和植物細(xì)胞中也參與DSB的同源重組修復(fù)[30,34-37]。在人體細(xì)胞中，Nse2通過(guò)Smc6和DNA修復(fù)蛋白TRAX的類(lèi)泛素化促進(jìn)DNA同源重組修復(fù)功能[14]。此外，Nse2通過(guò)介導(dǎo)Smc5蛋白的泛素化作用，在DNA損傷修復(fù)、DNA復(fù)制和維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[38,39]。在非洲爪蟾卵細(xì)胞中鑒定得到兩個(gè)新的蛋白因子Slf1和Slf2，與Rad18蛋白形成Rad18-Slf1-Slf-2三聚體復(fù)合物，招募Smc5/6復(fù)合體到DNA損傷位點(diǎn)降低基因組的不穩(wěn)定性[40]。在擬南芥中，Nse1、Nse3和Nse4蛋白功能的缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷修復(fù)缺陷[41-43]。雖然在人體和酵母細(xì)胞中Nse1沒(méi)有檢測(cè)到泛素化酶活性，但Nse1對(duì)于DNA損傷修復(fù)、染色體復(fù)制及穩(wěn)定性是必需的[12]。

2.2 緩解DNA復(fù)制壓力

細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制不僅受到細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響，而且由于DNA復(fù)制過(guò)程中超螺旋結(jié)構(gòu)的積累和姐妹染色體纏繞(SCIs)形成的拓?fù)鋲毫?huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制無(wú)法順利進(jìn)行，只有去除DNA超螺旋結(jié)構(gòu)和染色體纏繞才能使得DNA復(fù)制順利進(jìn)行[44]。研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復(fù)合體在去除DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的積累及姐妹染色體纏繞形成的拓?fù)鋲毫^(guò)程中發(fā)揮重要作用，通過(guò)去除復(fù)制過(guò)程產(chǎn)生的有害中間體或者重新啟動(dòng)受阻的復(fù)制叉進(jìn)而保證DNA復(fù)制順利進(jìn)行[27,45]。通過(guò)對(duì)Smc5/6復(fù)合體的定位和表型分析，發(fā)現(xiàn)Smc5/6復(fù)合體參與DNA的復(fù)制過(guò)程：在釀酒酵母有絲分裂S期，Smc5/6存在于染色體的復(fù)制初始位點(diǎn)，而在G2/M期其分布方式類(lèi)似于黏連蛋白的分布方式，Smc5/6存在方式的改變表明其與復(fù)制叉有關(guān)系并跟隨復(fù)制叉一起前行[31,46]。釀酒酵母中拓?fù)洚悩?gòu)酶Top1和Top2協(xié)同作用去除DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及SCIs[46]，而在人體細(xì)胞中Smc5/6復(fù)合體功能的缺失導(dǎo)致拓?fù)洚悩?gòu)酶Top2異常分布，從而進(jìn)一步導(dǎo)致超螺旋結(jié)構(gòu)、SCIs積累及染色體的異常分離[47],這一結(jié)果表明Smc5/6復(fù)合體通過(guò)影響拓?fù)洚悩?gòu)酶的分布進(jìn)一步參與DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及SCIs的去除。此外，Smc5/6復(fù)合體在降解由DNA復(fù)制引起的有害重組中間體以及重新啟動(dòng)復(fù)制叉的前行中也具有重要作用[48]。在DNA復(fù)制的模板置換過(guò)程中，DNA的模板鏈和合成鏈發(fā)生相互交連形成“X”型的HJ中間體，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制無(wú)法正常進(jìn)行。釀酒酵母中Smc5/6復(fù)合體定位分析發(fā)現(xiàn)其存在于終止的復(fù)制叉位點(diǎn)，且在Smc5/6突變體中發(fā)現(xiàn)“X”型重組中間體的積累，表明Smc5/6復(fù)合體可能與重組中間體的修復(fù)相關(guān)[32]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酵母中RecQ型解旋酶(Sgs1)通過(guò)與多聚SUMO鏈和Smc5/6復(fù)合體的SUMO E3復(fù)合體相互作用，利用泛素化途徑降解同源重組形成的中間體[32,33]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Nse5和Nse6蛋白在減數(shù)分裂的DNA重組中間體的清除和緩解復(fù)制壓力方面具有重要作用[49,50]。在裂殖酵母中Smc5/6復(fù)合體的SUMO連接酶活性及其與染色體的結(jié)合依賴(lài)于Nse5-Nse6二聚體，而且Brc1與Nse5-Nse6二聚體發(fā)生相互作用，引導(dǎo)Smc5/6復(fù)合體定位于DNA復(fù)制叉位點(diǎn)，促進(jìn)Smc5/6復(fù)合體對(duì)DNA復(fù)制過(guò)程產(chǎn)生的錯(cuò)誤復(fù)制叉的清除[51]。

2.3 維持端粒長(zhǎng)度

Smc5/6復(fù)合體在維持端粒長(zhǎng)度方面的研究相對(duì)較少，只在酵母細(xì)胞及人體細(xì)胞中有少量報(bào)道[52-54]。研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復(fù)合體存在于染色體的末端[55]。在酵母細(xì)胞中，組成Smc5/6復(fù)合體的Nse2、Smc5和Smc6蛋白功能的缺失會(huì)導(dǎo)致端粒的縮短以及衰老[52]。在端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞中，smc6-9基因缺失在染色體終端表現(xiàn)出由于同源重組缺陷引起的重復(fù)序列錯(cuò)誤分離。另外，mms21-11基因缺失表現(xiàn)出端粒聚集缺陷進(jìn)而增加端粒位置效應(yīng)(TPE)[15,52,53]。在端粒酶陰性細(xì)胞中，smc6-9和mms21-11等位基因突變加速了由于重組中間體積累引起的細(xì)胞衰老及DNA復(fù)制提前終止[55]。Sir4是端粒位置效應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復(fù)合體能與Sir4發(fā)生相互作用，對(duì)端粒位置效應(yīng)有重要影響[56]。

where Km(x) is the modified Bessel function, and Im(x) is the modified Hankel function, , , and b is the propagation constant. Similarly, the eigenvalue equation of the HEmnmode can also be derived (Supplementary information Section 1).

2.4 維持細(xì)胞正常分裂

細(xì)胞的正常分裂是生物體生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復(fù)合體對(duì)細(xì)胞的正常分裂具有重要作用。在模式植物擬南芥中，Nse2通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞分裂素信號(hào)通道的調(diào)控來(lái)維持根部細(xì)胞的正常分裂[57]。Nse1和Nse3蛋白功能的缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞分裂異常，進(jìn)而影響植株胚胎的發(fā)育及種子的形成[41]。Nse3在有絲分裂染色體的正常分離過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[7]。在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)功能保守的Nse4同源蛋白(Nse4A和Nse4B)，nse4突變株在減數(shù)分裂染色體分離、植株生長(zhǎng)和種子形成方面存在嚴(yán)重缺陷，表明Nse4蛋白在維持正常的減數(shù)分裂、植株的生長(zhǎng)和種子形成過(guò)程中具有重要作用[42,43]。在擬南芥植株中同時(shí)敲除smc6a和smc6b基因?qū)?yán)重影響植株配子和種子的形成[58]。通過(guò)擬南芥自然變異植株，鑒定得到Smc5/6復(fù)合體亞蛋白Sni1，其對(duì)細(xì)胞減數(shù)分裂交叉點(diǎn)分布具有調(diào)控作用，揭示Smc5/6復(fù)合體在植物減數(shù)分裂同源重組中具有重要的功能[59]。

2.5 其他功能

近期研究表明，Smc5/6復(fù)合體不僅在DNA損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、維持端粒長(zhǎng)度和正常細(xì)胞分裂等方面發(fā)揮重要作用，而且在維持核糖體功能、細(xì)胞凋亡調(diào)控及抑制病毒增殖等方面也發(fā)揮重要作用。在釀酒酵母中，Nse2(Mms21)功能的缺失導(dǎo)致核糖體RNA產(chǎn)量減少和核糖體蛋白在細(xì)胞核中的積累，表明Nse2對(duì)維持細(xì)胞核的正常功能也具有重要作用[60]。近期在玉米中對(duì)Nse2同源蛋白(MMS21)的SUMO化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致種子致死、花粉和種子萌發(fā)嚴(yán)重受損[61]。在網(wǎng)柄菌Dictyosteliumdiscoideum中，通過(guò)RNA干擾降低Nse4蛋白的表達(dá)，增加了紫外照射引起的細(xì)胞凋亡和由饑餓誘導(dǎo)形成的子實(shí)體的數(shù)目[62]。此外，Smc5/6復(fù)合體作為病毒抑制子在控制病毒增殖方面具有重要作用[63，64]。

3 總結(jié)

本文從Smc5/6復(fù)合體的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能兩個(gè)方面對(duì)近年來(lái)Smc5/6復(fù)合體的研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述。Smc5/6復(fù)合體在DSB同源重組修復(fù)、消除DNA復(fù)制壓力、去除有害的復(fù)制中間體及維持端粒的長(zhǎng)度等方面發(fā)揮重要作用。此外，Smc5/6復(fù)合體在胚胎發(fā)育、維持核糖體功能和抑制病毒增殖等方面也有相關(guān)報(bào)道，但其作用機(jī)制尚不清楚[34]。關(guān)于Smc5/6復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能在酵母細(xì)胞中的報(bào)道相對(duì)較多，在植物中的報(bào)道較少，而在整體動(dòng)物模型水平上幾乎沒(méi)有報(bào)道。對(duì)Smc5/6各亞基的功能研究較少，特別是Nse1、Nse3、Nse4、Nse5、Nse6蛋白亞基的分子作用機(jī)制在很大程度上是未知的。因此，關(guān)于Smc5/6復(fù)合體和各亞基在植物和整體動(dòng)物模型中的功能與分子作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探索。