紅樹林土壤中假單胞菌群的重金屬耐受活性*

李 菲，李 喆，黃庶識，蘇芯瑩，覃仙玲**

(1.廣西科學(xué)院，廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；2.廣西科學(xué)院，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

0 引言

目前，我國耕地土壤重金屬污染形勢嚴(yán)峻，污染面積大，且污染重金屬種類多、含量高，全國重金屬污染耕地約2 000 hm2，約占全國總耕地面積的16.7%，部分污染嚴(yán)重的耕地，重金屬含量可高達(dá)安全限值的100倍[1]。重金屬污染物的生物毒性大，易與化肥、農(nóng)藥以及抗生素等有機(jī)物結(jié)合，生成更具毒性的有機(jī)金屬化合物，極大影響并危害生物體正常生長。再者，重金屬污染物吸附在土壤顆粒上，既降低土壤微生物活性、抑制植物根系對營養(yǎng)元素吸收，也極易被農(nóng)作物吸收富集[2,3]?；谥亟饘傥廴疚锏倪w移、富集特性，生物體中的重金屬濃度可能倍增至生境中的上萬倍，而重金屬沿食物鏈逐級進(jìn)入人體內(nèi)并長期富集積累后，會對人體產(chǎn)生巨大危害，如鉛污染會對人體的造血、神經(jīng)和消化系統(tǒng)有較明顯傷害[4]，會導(dǎo)致人體四肢酸痛、貧血、神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病、肝/腎損傷、心血管器質(zhì)性疾病、智力下降(特別是兒童)及中樞神經(jīng)和造血系統(tǒng)的損傷等[5]；鎘污染可能會導(dǎo)致人體的消化系統(tǒng)遭受破壞，腎、肝功能失調(diào)，骨質(zhì)疏松，人體器官致癌致畸[6]；六價(jià)鉻污染會損傷人體呼吸系統(tǒng)，破壞人體細(xì)胞中DNA致使細(xì)胞畸變[7]；銅污染會使人體出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃燒灼感等癥狀，重者會出現(xiàn)腹痛、吐血、溶血性黃疸、貧血、肝大、血紅蛋白尿、急性腎功能衰竭和尿毒癥[7]；人類食用鈷污染的食品，輕者脫發(fā)，重者會引起血液系統(tǒng)疾病[8]。

修復(fù)重金屬污染的耕地土壤，能有效地將污染源遏制在食物鏈最底端，其主要途徑有去除化和固定(或穩(wěn)定)化。去除化是將土壤中的重金屬污染物提取出去；固定(或穩(wěn)定)化是改變土壤中重金屬的存在形態(tài)，以消除生物毒性[9]。其中，微生物修復(fù)作為固定(或穩(wěn)定)化技術(shù)中的研究熱點(diǎn)，主要是利用微生物對重金屬的親合、吸附、轉(zhuǎn)化效應(yīng)，降低土壤中重金屬的有效濃度。微生物治理法具有成本低、效率高，一般不需要停耕，可進(jìn)行原位修復(fù)，能改善土壤環(huán)境、提升土壤肥力等優(yōu)勢；但該方法同時(shí)具有對重金屬固定性有限、代謝能力不佳、微生物流失或被吞噬等缺點(diǎn)[1,10,11]。因此，尋找耐受力強(qiáng)、適用范圍廣的微生物類型，可對微生物在實(shí)際應(yīng)用中的強(qiáng)化和聯(lián)合修復(fù)工作提供更好的幫助。

假單胞菌群是一類活躍在植物根際的革蘭氏陰性菌，能產(chǎn)生多種抗生素，改善植物營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長，降解土壤中有毒物質(zhì)及起防病殺蟲作用等[12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，熒光銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaCW-96-1在有氧培養(yǎng)過程中，可以通過沉淀硫化鎘去除溶液中99%以上的Cd2+。Pramanik等[14]發(fā)現(xiàn)一株P(guān)seudomonassp.K32對Cd2+、Pb2+和As3+高度耐受，在Cd2+脅迫下表現(xiàn)出固氮和溶磷能力且能產(chǎn)生生長素IAA，促進(jìn)水稻(Oryzasativa)幼苗生長，同時(shí)，對多種植物病原真菌有顯著抑制作用及產(chǎn)生大量的功能酶。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生PseudomonasputidaRE02可定植在白三葉(Trifoliumrepens)根際和根內(nèi)，對鎘、鉻和鉛金屬高度耐受，且能促進(jìn)植物發(fā)芽，提高土壤肥力。Mokrani等[16]研究發(fā)現(xiàn)，兩株固氮假單胞菌Pseudomonasazotoformans對Cd2+和Pb2+有很強(qiáng)耐受性，且能拮抗多種植物病原菌。此外，鑒于紅樹林處于海水與淡水交互的特殊地帶，其沉積物中富含有機(jī)質(zhì)，且具有一定的厭氧性和還原性，進(jìn)而可以結(jié)合更多的重金屬，使其成為重金屬污染物的“匯”[17]。故本研究從紅樹林土壤中分離假單胞菌群，并對其開展重金屬耐受活性研究，旨在獲得對多種重金屬都有高耐受活性的菌株，并檢測菌株的修復(fù)能力，為微生物修復(fù)技術(shù)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅樹林土壤樣本

2021年8月初從廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)(108°36′14″ E，21°44′53″ N)中采集3處土壤樣本，待潮水退至最低潮時(shí)，從最靠近海端的紅樹林往回隨機(jī)采集(每處間隔5 m)，樣品采集深度為0.5 m，將樣品均裝于密封袋，于4℃低溫保藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)分離/純化培養(yǎng)基：2216E固體培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物有限公司)；改良ISP2固體培養(yǎng)基(麥芽提取粉2.0 g，酵母提取粉2.0 g，葡萄糖2.0 g，去離子水1 000 mL，海鹽25.0 g，瓊脂14.0 g)。

(2)重金屬耐受實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：改良ISP2培養(yǎng)基，BE培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g，去離子水1 000 mL)。分別用去離子水配制6 400 μg/mL的CoCl2、ZnSO4、CdSO4、CuSO4、Pb(NO3)2和K2Cr2O7溶液，無菌過濾后即為重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化

稱取2.0 g混合樣品裝于20 mL無菌海水(添加1%的吐溫20)，180 r/min搖床處理30 min后，稀釋成10-2和10-3濃度的樣液備用。取200 μL稀釋的樣液涂布至2216E固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7 d，挑取肉眼可見菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù)，以30% (V/V)甘油-ISP2混合液作為保護(hù)劑，將純化好的菌株制成凍存管保藏于-70℃冰箱。

1.2.2 16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用chelex-100樹脂[18]快速提取細(xì)菌的DNA作為PCR模板，并根據(jù)Walsh等[19]的方法對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增和測序引物均為細(xì)菌通用引物27F和1492R，PCR反應(yīng)條件參照李菲等[20]的方法設(shè)定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行在線比對[21]；選取同源性最高菌株的序列作為參比對象，運(yùn)用MEGA 10.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Boostrap 1 000次檢測各分支的置信值，對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析[22]。

1.2.3 重金屬耐受菌的初篩

以改良ISP2或BE固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加6種重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液使其終濃度為100 μg/mL，將待測菌株劃線于該培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d，觀察其生長狀況，并記錄其結(jié)果。

1.2.4 耐受菌的重金屬離子最大耐受濃度

根據(jù)肉湯稀釋法[23]測定重金屬離子抑制待測菌株的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)，即細(xì)菌對重金屬最大耐受濃度。各取60 μL重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別加入96孔板的第1列，加入60 μL改良ISP2或EB(Pb2+)液體培養(yǎng)基，混合均勻后，吸取60 μL混合液至第2列孔內(nèi)，再加入60 μL改良ISP2或EB(Pb2+)液體培養(yǎng)基，混合均勻后，吸取60 μL混合液至第3列孔內(nèi)，以此類推，稀釋至第6列孔內(nèi)。第1至第6列的重金屬離子濃度依次為3 200，1 600，800，400，200及100 μg/mL，第7列加60 μL改良ISP2或EB(Pb2+)液體培養(yǎng)基作為陽性對照，以各濃度下的重金屬離子溶液(不加菌)作為陰性對照，每組3個(gè)平行。用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒋嚲甑木鷳乙簼舛日{(diào)至約108CFU/mL，分別加入第1至第7列96孔板中。28℃培養(yǎng)5 d，用酶標(biāo)儀測定其OD600值。

1.2.5 菌株的重金屬耐受基因檢測

采用1.2.2節(jié)的方法提取細(xì)菌中的DNA，對重金屬耐受基因進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度均設(shè)置為58℃，參數(shù)[24,25]詳見表1。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

表1 假單胞菌的重金屬耐受基因檢測引物

1.2.6 菌株對重金屬離子的吸附能力

取活性顯著對數(shù)生長期菌株分別接種至100 mL改良ISP2培養(yǎng)基中，置于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2-3 d，用紫外分光光度計(jì)測定培養(yǎng)物的OD600值，待其OD600值趨于穩(wěn)定，用無菌離心管收集全部菌體，8 000 r/min離心10 min，棄上清液,收集菌體沉淀，用無菌水洗滌3次，用0.9%生理鹽水重懸菌體后置于4℃冰箱中保存14-16 h，即可得到休止細(xì)胞溶液。將休止細(xì)胞溶液置于50 mL離心管(設(shè)置3組平行)，5 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，稱量濕菌體重量，再用已配制好的重金屬離子溶液重懸菌體，重金屬離子終濃度為400 mg/L，28℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。以接種前的重金屬離子溶液作為對照組，用原子吸收光譜儀測定重金屬離子濃度，并計(jì)算其吸附率和吸附能力，公式：吸附率=(對照組重金屬離子濃度-實(shí)驗(yàn)組重金屬離子濃度)/空白組重金屬離子濃度×100%；吸附能力=溶液體積×(對照組重金屬離子濃度-實(shí)驗(yàn)組重金屬離子濃度)/細(xì)胞干重，單位為mg金屬/g菌體。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹林土壤中可培養(yǎng)假單胞菌

從廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)土壤中共獲得77株細(xì)菌，通過形態(tài)、大小、顏色等形態(tài)學(xué)特征及革蘭氏染色進(jìn)行初步排重，選取42株革蘭氏陰性菌進(jìn)行16S rRNA基因測序，結(jié)果共獲得23株假單胞菌，并對其構(gòu)建Neighbour-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

圖1 土壤中假單胞菌的16S rRNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 假單胞菌的重金屬耐受活性初篩結(jié)果

23株假單胞菌在各重金屬培養(yǎng)基上生長情況如下：能在含100 μg/mL Cu2+，Pb2+，Cr6+，Cd2+，Co2+和Zn2+培養(yǎng)基上生長的假單胞菌分別有16，18，14，10，4和15株；總陽性率分別為69.56%，78.26%，60.87%，43.48%，17.39%和65.22%。其中，Y390，Y193和Y122均不能在各重金屬培養(yǎng)基上生長；Y123，Y225，Y167和Y150均在含Co2+培養(yǎng)基上長出少量菌落；Y286和Y336均在含Pb2+和Cr6+培養(yǎng)基上長出少量菌落，在其他重金屬培養(yǎng)基上未見菌苔。此外，重金屬培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)發(fā)生了變化，如Cu2+培養(yǎng)基上，Y234的菌體顏色由淺棕色變?yōu)闇\綠色，Y272的菌體顏色由微橙色變?yōu)楹稚?，且菌體表面較為干燥；Pb2+培養(yǎng)基上，Y234和Y167的菌體變?yōu)槌壬?，Y272的菌體變?yōu)樯詈稚?圖2)。

圖2 4株菌在各重金屬培養(yǎng)基上的生長情況

2.3 菌株的重金屬耐受性能

根據(jù)初篩結(jié)果，選出至少能在一種含有100 μg/mL重金屬培養(yǎng)基上生長的假單胞菌18株，進(jìn)一步摸索各菌株在不同重金屬離子中最大耐受濃度。由表2可知，可耐受800 μg/mL Pb2+的菌株有7株，4株菌對Pb2+的耐受活性可達(dá)1 600 μg/mL；耐受Zn2+的假單胞菌有6株，耐受Zn2+濃度在1 600 μg/mL以上；其中，有6株菌對Pb2+和Zn2+均有顯著耐受活性，分別為Y234、Y123、Y225、Y167、Y346和Y264。除此之外，對鉛和/或鋅耐受活性顯著的11株菌對其他多種重金屬，如Cu2+、Cr6+和Cd2+，也具有一定的耐受性，這可能與其生長的紅樹林生境有關(guān)。生活在被污染土壤中的微生物往往會通過改變自身的生化和結(jié)構(gòu)特征、生理特性和遺傳基因等來適應(yīng)環(huán)境，從而產(chǎn)生各種機(jī)制應(yīng)對各種復(fù)雜的環(huán)境[26]，這一特性暗示這些菌株對多種重金屬復(fù)合污染的水體具有修復(fù)潛能。

對23株假單胞菌進(jìn)行重金屬抗性基因檢測(表2和圖3)，最常見的基因是copB(21.74%)、copA(26.09%)、czcA(13.04%)和chrR(4.35%)，其中copA和copB基因與銅的抗性有關(guān)，czcA基因與鎘、鋅和鈷的抗性有關(guān)，chrR基因與鉻的抗性有關(guān)。綜合對假單胞菌在重金屬培養(yǎng)基上生長及攜帶重金屬抗性基因分析可知，在9株顯示copA和/或copB基因的菌株中，有7株表現(xiàn)出MIC (Cu2+)≥200 μg/mL。在不含copA或copB基因的14株菌中，有4株菌的MIC (Cu2+)≥200 μg/mL，3株菌的MIC(Cu2+)=100 μg/mL。23株假單胞菌中有3株檢測出czcA基因，其MIC (Zn2+)≥1 600 μg/mL；其余未檢出czcA的假單胞菌中，MIC (Zn2+)≥1 600 μg/mL的有3株，有3株菌的MIC (Zn2+)=200 μg/mL；23株假單胞菌對鎘和鈷的抗性均不顯著，MIC (Cd2+)≤400 μg/mL，MIC (Co2+)≤100 μg/mL。chrR基因僅在Y302中檢測到，其MIC (Cr6+)=100 μg/mL，其余未檢測出chrR基因的菌株中，有13株菌對Cr6+有一定的耐受性，其MIC (Cr6+)=100-200 μg/mL。

表2 18株假單胞菌的重金屬耐受活性

1-11號孔依次表示Marker，Y105，Y302，Y118，Y234，Y225，Y307，Y297，Y272，Y150和Y264。7條Marker指示帶從上至下表示2 000，1 000，750，500，250和100 bp

2.4 菌株對重金屬離子的吸附能力

選擇11株對鉛和/或鋅有耐受表征的假單胞菌進(jìn)行吸附性能測試，在排除明顯的儀器導(dǎo)致的測試誤差后，獲得5株顯著吸附Pb2+和/或Zn2+的菌株(圖4)。其中，鉛的吸附率排序?yàn)閅234>Y346>Y123>Y264>Y225，鉛吸附能力排序?yàn)閅346>Y234>Y123>Y225>Y264；鋅的吸附率排序?yàn)閅123>Y264>Y234>Y225>Y346，鋅吸附能力排序?yàn)閅123>Y234>Y264>Y225>Y346。其余6株菌株對富含Pb2+和/或Zn2+的溶液基本無去除作用(吸附率均在10%以下)。吸附能力是指生物體的吸附量，在相同的菌體質(zhì)量下，Y346對鉛的吸附量最大，其吸附能力最好；Y123對鋅的吸附量最大且吸附率最高，其吸附能力最強(qiáng)。

圖4 5株顯著活性菌株的吸附性能

3 討論

紅樹林微生物群落經(jīng)過長時(shí)間進(jìn)化，形成了特殊的生理代謝系統(tǒng)，在適應(yīng)生態(tài)環(huán)境與自我保護(hù)的同時(shí)，通過通信、覓食等行為機(jī)制來適應(yīng)特殊環(huán)境，如鹽脅迫、高礦物質(zhì)組成、強(qiáng)還原性、強(qiáng)酸性、強(qiáng)風(fēng)、強(qiáng)流、徑流、高溫、強(qiáng)輻射、頻繁的潮汐、缺氧污泥和寡營養(yǎng)等。獨(dú)特的生境必然會造成其微生物具有獨(dú)特的生物活性[27]。本研究選取廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)內(nèi)土壤作為研究對象，從中共獲得23株假單胞菌，其中有18株菌能在多種重金屬培養(yǎng)基上生長，11株菌對鉛和/或鋅的耐受性顯著，5株菌對鉛和/或鋅的吸附能力突出。

耐受基因檢測中，部分菌株檢測出重金屬耐受基因，但其在高濃度重金屬培養(yǎng)基上卻無法生長，如檢測出copA或copB基因的菌株Y307和Y118，其對銅的耐受濃度僅為100 μg/mL；部分檢測出czcA基因的菌株對鎘和鈷的耐受性差。究其原因，可能是在發(fā)酵條件下，大部分微生物基因簇是沉默的，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過改變培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、鹽度、pH、混合培養(yǎng)及表觀遺傳修飾劑等[28]，激活微生物中的沉默基因簇，從而使之表現(xiàn)出較高的重金屬耐受性。然而，部分菌株雖然未檢出耐受基因，但是在重金屬培養(yǎng)基上仍表現(xiàn)出很好的耐受活性，如Y123和Y346，其耐受基因可能存在于細(xì)胞質(zhì)粒中。

吸附能力實(shí)驗(yàn)中，有5株假單胞菌表現(xiàn)出良好的鉛和/或鋅吸附性能，鉛和/或鋅的吸附率分別為44.15%-75.20%和39.55%-82.38%，吸附能力分別為12.35-20.76 mg金屬/g菌體和9.58-20.79 mg金屬/g菌體。其中，銅綠假單胞菌Y234具有很強(qiáng)的重金屬吸附能力，這與許多報(bào)道的結(jié)論一致[23,24,29]，但因其是條件致病菌，且感染免疫力低下人群，易具有多重耐藥性及難治療等因素，因此難以廣泛應(yīng)用于修復(fù)重金屬污染的環(huán)境。重金屬固定細(xì)菌是通過固定鈍化土壤/溶液中的重金屬，減少重金屬總量或者有效態(tài)含量，其作用機(jī)制主要有細(xì)胞壁吸附[30,31]、表面絡(luò)合[32]、細(xì)胞內(nèi)富集[33]和胞外沉淀[34]等。后續(xù)將對4株吸附能力好的假單胞菌開展掃描電鏡-能譜觀察、傅里葉紅外光譜及X衍射分析，以研究其作用機(jī)理，為更好地開展修復(fù)重金屬污染環(huán)境工作做準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)內(nèi)土壤富含假單胞菌群資源，且部分菌株的重金屬耐受活性顯著。其中，菌株Y234、Y123、Y264、Y225和Y346對重金屬鋅和/或鉛表現(xiàn)出良好的吸附特性，在降解有毒物質(zhì)和改善植物微環(huán)境方面具有較大潛力。