闌尾切除改變腸道菌群對結(jié)直腸癌預(yù)后影響的臨床研究*

劉改霞 邱銓鵬 任博博 張浩為 劉輝 李雯 石晨 佘軍軍

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率以及死亡率分別居于全球腫瘤的第3 位和第4 位，每年有近90 萬人因其死亡[1]。在中國，近年來隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率持續(xù)增高[2]。腸道菌群紊亂在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。結(jié)直腸癌組織中富集的細(xì)菌如具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）、厭氧消化鏈球菌（Peptostreptococcus anaerobius）、產(chǎn)腸毒素?cái)M桿菌（Enterotoxigenic bacteroides）等可以通過直接誘導(dǎo)DNA 損傷，激活某些致癌信號(hào)通路等促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[3]。而腸道中某些有益的細(xì)菌，如勞氏菌屬可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其具有抗炎，修復(fù)腸道上皮損傷，維持腸道穩(wěn)態(tài)的功能[3]。

近年來大量研究顯示，闌尾切除也會(huì)增加術(shù)后結(jié)直腸癌的發(fā)生率。Mcvay 等[4]最早通過患者死亡后尸檢研究發(fā)現(xiàn)，因結(jié)直腸癌死亡的病例中闌尾切除率遠(yuǎn)高于因其他疾?。ㄐ难芗膊　⑵渌麗盒阅[瘤等）死亡病例中的闌尾切除率，從而提出闌尾可能作為腸道抵抗惡性病變的一種重要結(jié)構(gòu)與腸道惡性疾病密切相關(guān)。Lai 等[5]回顧性研究從1998年至2003年醫(yī)院確診的急性闌尾炎患者，發(fā)現(xiàn)40 歲以上有過闌尾炎病史的人群患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)比是普通人群的38.5 倍。且有研究表明，長期隨訪闌尾切除后人群，其腸道菌群多樣性和豐富度明顯降低，糞便菌群組成發(fā)生明顯改變[6]。隨著對闌尾角色與功能研究的不斷深入，大量闌尾與結(jié)直腸癌關(guān)系的相關(guān)研究相繼被報(bào)道和開展中[7]，但是闌尾切除與其后結(jié)直腸癌預(yù)后之間的關(guān)系，目前尚未明確，其潛在機(jī)制也需要進(jìn)一步探索。

本研究回顧了西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者的臨床資料，旨在探究既往闌尾切除與結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步基于小鼠闌尾切除模型，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌，闡明小鼠糞便菌群組成變化，進(jìn)行初步機(jī)制探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 回顧性收集2013年1月至2016年12月期間于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的1 092 例結(jié)直腸癌患者的臨床以及病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡20～80 歲；2）經(jīng)病理組織學(xué)診斷為結(jié)直腸腺癌；3）未合并其他類型腫瘤；4）臨床及病理資料信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）結(jié)直腸癌診斷前既往患有其他腫瘤的患者；2）既往有炎癥性腸病、家族性腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌等遺傳性結(jié)直腸癌的患者；3）闌尾切除后一年之內(nèi)發(fā)生結(jié)直腸癌的病例；4）因闌尾腫瘤行闌尾切除術(shù)或結(jié)腸切除的病例。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，最終納入763 例病例。根據(jù)患者在結(jié)直腸癌診斷前是否存在闌尾切除史，將其分為闌尾切除組（89 例）和非闌尾切除組（674 例）。通過病歷記錄中既往闌尾切除病史及住院期間腹部CT 等影像學(xué)檢查評價(jià)結(jié)直腸癌診斷前闌尾切除史。

1.1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料 氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉購自美國sigma-aldrich 公司，糞便DNA 基因組提取試劑盒購自德國Qiagen 公司，qRT-PCR 引物由中國生工生物工程公司合成及測序，相關(guān)引物序列：普氏菌屬：F：5'-AATAAGGACCGGCTAATTCCGT-3'，R：5'-CTACGCTCCCTTTAAACCCAAT-3'；擬桿菌屬：F：5'-CGGTAATACGGAGGATCCGA-3'，R：5'-CCTACG CTCCCTTTAAACCC-3'；布氏菌屬：F：5'-GACGGTA CCTGACTAAGAAGCC-3'，R：5'-TCAACAGTTTCCA ATGCAGTCC-3'；細(xì)菌通用引物：F：5'-GCAGGCCT AACACATGCAAGTC-3'，R： 5'-CTGCTGCCTCCCGT AGGAGT-3'[8]。

1.2 方法

1.2.1 臨床數(shù)據(jù)分析 通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院于生物樣本信息資源中心收集結(jié)直腸癌患者去隱私化相關(guān)臨床信息，包括：性別、年齡、診斷、既往史、吸煙飲酒史、家族史、治療方法、術(shù)后是否放化療、是否R0 切除；其中吸煙飲酒史進(jìn)行分級(jí)，將吸煙狀態(tài)分為3 個(gè)等級(jí)：不吸煙者，戒煙者，現(xiàn)在吸煙者；將飲酒狀態(tài)分為2 個(gè)狀態(tài)：不飲酒者，飲酒者（包括輕、中、重度飲酒者）[9]。腫瘤臨床病理特征：病理診斷、腫瘤位置、腫瘤病理分期、腫瘤臨床分期（采用第8 版國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)的TNM 分期）、腫瘤分化程度（采用世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)）；其中腫瘤位置根據(jù)國際腫瘤學(xué)疾病分類，分為近端結(jié)腸（盲腸-結(jié)腸脾曲）、遠(yuǎn)端結(jié)腸（降結(jié)腸-乙狀結(jié)腸）、直腸（直乙交界-直腸）[10]。預(yù)后信息：存活狀態(tài)、是否復(fù)發(fā)、是否轉(zhuǎn)移、死亡原因、死亡日期。

1.2.2 隨訪 隨訪信息采集方式包括門診復(fù)查及電話隨訪。隨訪內(nèi)容包括患者的疾病發(fā)展情況、生存狀態(tài)及死亡原因等。隨訪終點(diǎn)為2020年3月1 日或患者死亡。納入研究的763 例患者中，64 例患者因聯(lián)系方式變更等原因失訪，總失訪率為8.39%。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1）動(dòng)物分組和模型建立：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性C57BL/6 小鼠30 只，8～10 周齡，體重為20～26 g。所有小鼠均飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每籠5 只，飼養(yǎng)溫度嚴(yán)格控制在（22±2）℃，光暗循環(huán)（光照12 h，黑暗12 h），小鼠均自由攝取食物和飲水。參照本課題組已發(fā)表研究制作小鼠闌尾切除模型，其中對照組進(jìn)行假手術(shù)處理。手術(shù)操作后正常飼養(yǎng)7 天后，均進(jìn)行氧化偶氮甲烷（AOM）+ 葡聚糖硫酸鈉（DSS）結(jié)直腸癌誘導(dǎo)（圖1）[11]。2）動(dòng)物標(biāo)本采集和處理：實(shí)驗(yàn)第11 周，所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，采集小鼠全段結(jié)直腸，剖開腸腔，收取所有糞便顆粒于-80℃凍存，在顯微鏡下進(jìn)行腸黏膜大體觀察，留取疑似腫瘤的部分腸段進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋切片后行H&E 染色，進(jìn)行病理診斷。3）qPCR 糞便細(xì)菌定量：根據(jù)病理結(jié)果，隨機(jī)選取闌尾切除組發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只，未發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只，對照組發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只，未發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只。采用糞便DNA 基因組提取試劑盒進(jìn)行糞便DNA 提取。選擇細(xì)菌屬水平16 S rRNA 基因的保守區(qū)域（V3-V4 區(qū)域）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，目標(biāo)菌屬的豐度用2?ΔCt（其中ΔCt=每個(gè)目標(biāo)菌屬的平均Ct 值-細(xì)菌總數(shù)的平均Ct 值）作進(jìn)行計(jì)算。兩組之間的差異比較采用t檢驗(yàn)。

圖1 小鼠闌尾切除后結(jié)直腸癌誘導(dǎo)模型制作流程圖[11]

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s 表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（范圍）表示，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比表示?？傮w生存率的分析采用Kaplan-Meier 法，組間生存比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。采用Cox 回歸分析明確闌尾切除史是否為結(jié)直腸癌獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料

闌尾切除組患者和非闌尾切除組患者臨床基本特征如表1 所示，兩組在年齡分布、性別組成、吸煙飲酒史、糖尿病史、腫瘤臨床分期、腫瘤TNM 分期、術(shù)后放化療、是否R0 切除方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 闌尾切除組與非闌尾切除組基本臨床資料 例（%）

表1 闌尾切除組與非闌尾切除組基本臨床資料 （續(xù)表1）

2.2 闌尾切除與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier 生存分析顯示，闌尾切除組中位生存時(shí)間為55.000（95%CI：38.654～71.346）月；闌尾切除組的1、3、5年總體生存率分別為：88.8%、61.8%、46.4%，非闌尾切除組的1、3、5年總體生存率分別為：89.5%，75.1%，69.3%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.777，P<0.01，圖2）。Cox 單因素分析顯示：年齡、闌尾切除、腫瘤病理分期、腫瘤臨床分期、腫瘤分化、腫瘤位置、糖尿病、R0 切除、術(shù)后放/化療均與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)（P<0.05，表2）；將以上危險(xiǎn)因素和性別納入Cox 多因素分析，結(jié)果顯示闌尾切除是結(jié)直腸癌預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素[HR=1.475，95%CI：1.030～2.114；P=0.034，表2]。根據(jù)性別、年齡、腫瘤分化、腫瘤臨床分期、腫瘤位置、糖尿病、R0 切除、術(shù)后放化療進(jìn)行校正，Cox 多因素回歸結(jié)果顯示：闌尾切除后1～3年內(nèi)發(fā)生結(jié)直腸癌的患者其死亡風(fēng)險(xiǎn)是無闌尾切除史的結(jié)直腸癌患者的2.772 倍（95%CI：1.272～6.043，表3）。

表2 不同因素對于結(jié)直腸癌總生存率影響的Cox 單因素與多因素回歸分析

表2 不同因素對于結(jié)直腸癌總生存率影響的Cox 單因素與多因素回歸分析 （續(xù)表2）

表3 闌尾切除暴露時(shí)間與結(jié)直腸癌總生存率相關(guān)關(guān)系的Cox 單因素與多因素回歸分析

圖2 闌尾切除與非闌尾切除結(jié)直腸癌患者總生存率曲線

2.3 闌尾切除后結(jié)直腸癌小鼠的糞菌變化

利用qPCR 檢測腸道細(xì)菌屬水平變化，在發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠中，相比于未行闌尾切除的小鼠糞菌，闌尾切除的小鼠腸道中普氏菌屬明顯富集（P<0.01）。闌尾切除小鼠，經(jīng)AOM+DSS 誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)直腸癌其糞菌中，相比于未發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠，普氏菌屬（圖3A)、擬桿菌屬（圖3B）的相對豐度明顯升高、布氏菌屬（圖3C）明顯減少。而對于未行闌尾切除的小鼠，經(jīng)AOM+DSS 誘導(dǎo)后不管是否發(fā)生結(jié)直腸癌，3 個(gè)菌屬豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 闌尾切除后結(jié)直腸癌誘導(dǎo)小鼠模型糞便中普氏菌屬、擬桿菌屬、布氏菌屬相對豐度

3 討論

近年來，隨著對闌尾功能認(rèn)識(shí)的不斷深入，大量研究表明其在腸道免疫和維持腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用[12]。闌尾作為腸道相關(guān)淋巴組織重要的一部分，對腸道疾病以及腸外疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸具有一定的影響[13]。目前，越來越多的研究表明闌尾切除會(huì)增加術(shù)后罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[14]，本研究目的在于進(jìn)一步探究闌尾切除與結(jié)直腸癌預(yù)后之間的關(guān)系以及可能潛在的機(jī)制。

本研究回顧性分析了763 例結(jié)直腸癌患者的（闌尾切除組89 例，非闌尾切除組674 例）預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)既往切除闌尾的結(jié)直腸癌患者較無闌尾切除史的結(jié)直腸癌患者，死亡風(fēng)險(xiǎn)比更高，同時(shí)，闌尾切除是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本課題組通過建立小鼠闌尾切除模型，進(jìn)行AOM+DSS 炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)闌尾切除后發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠相比于闌尾未切除發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠，其糞便中普氏菌屬豐度明顯增加。多項(xiàng)研究表明普氏菌屬與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其在右半結(jié)腸癌中豐度明顯增高，且與其不良預(yù)后相關(guān)[15]；正常人口腔中也富含普氏菌屬，研究表明來源于口腔中的普氏菌屬在腸道定植增加會(huì)引起腸道菌群的紊亂，招募更多的“壞細(xì)菌”富集，在腸黏膜上形成菌斑，引起腸道炎癥，增加結(jié)直腸癌的發(fā)生[16]。

本研究認(rèn)為闌尾-免疫-腸道細(xì)菌三者相互作用，相互影響，在結(jié)直腸癌發(fā)展、預(yù)后中起重要作用。闌尾黏膜層中富含Treg 細(xì)胞、M 細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞[12]，闌尾作用失調(diào)或者完全喪失，使腸道局部免疫監(jiān)視功能減弱，以及腫瘤組織中免疫微環(huán)境改變，相比于無闌尾切除史的同年齡段結(jié)直腸癌患者，闌尾切除的結(jié)直腸癌患者其腸道局部免疫能力較為低下，造成其預(yù)后不良。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞由不同比例T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞組成。大量研究表明，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞代表宿主腫瘤免疫防御機(jī)制，其在腫瘤組織中的豐度與癌癥患者的生存率相關(guān)，包括結(jié)直腸癌[17]有研究指出腸道共生微生物可在腸道黏膜定植形成生物膜，其形成需要免疫系統(tǒng)的參與，其中IgA 對微生物在腸黏膜上的定植、調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持起主要作用[18]；而闌尾是腸道分泌IgA 的主要器官，其功能的缺失會(huì)影響腸道黏膜生物膜的形成，進(jìn)而影響腸道菌群以及腫瘤組織中菌群微環(huán)境的結(jié)構(gòu)。而某些腸道細(xì)菌又可以通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、腫瘤代謝等進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤不良預(yù)后[19]。

本研究表明，闌尾切除1～3年內(nèi)發(fā)生結(jié)直腸癌的患者其死亡風(fēng)險(xiǎn)比明顯高于闌尾切除暴露時(shí)間>3年的結(jié)直腸癌患者；其可能與腸道相關(guān)淋巴組織代償能力有關(guān)。Masahata 等[20]將無菌小鼠進(jìn)行闌尾切除后發(fā)現(xiàn)其全結(jié)直腸以及糞便中的IgA 分泌細(xì)胞數(shù)量顯著降低，且糞菌發(fā)生變化；將闌尾切除后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)8 周后，發(fā)現(xiàn)其大腸孤立淋巴組織數(shù)量變多，體積變大，IgA 分泌細(xì)胞數(shù)量回升，與假手術(shù)組無顯著差異。

根據(jù)初步研究結(jié)果，闌尾切除可能是結(jié)直腸癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其潛在機(jī)制可能與闌尾切除可以改變腸道細(xì)菌有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。