半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1 信號通路介導(dǎo)的細胞焦亡在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用

高 攀，石永強（通訊作者），趙向陽，王小平，陳 躍，王 輝，吳新國，荊 揚，宋用強

（南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 江蘇 南京 211200）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）是一種主要侵犯結(jié)直腸黏膜以及黏膜下層病因不明確腸道非特異性、慢性炎癥，主要的臨床特征表現(xiàn)是腹痛、腹瀉以及黏液膿血便。在我國UC 患者中，以中年患者居多。UC 的臨床特征表現(xiàn)是慢性復(fù)發(fā)性，過程中表現(xiàn)為受累腸黏膜炎癥浸潤或消退[1]。近年來，我國UC 的發(fā)病率和患病率表現(xiàn)出快速上升態(tài)勢，且因其病程長、難治愈，公認為難治性疾病之一。UC 的發(fā)病機制尚未明確，仍需進一步研究其分子機制，UC 的形成與發(fā)展是菌群失調(diào)、免疫紊亂、宿主易感等多種因素相互作用的結(jié)果，腸黏膜慢性炎癥持續(xù)存在是其顯著的特點[2]。細胞焦亡是新發(fā)現(xiàn)一種依賴于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific protease 1, Caspase-1）介導(dǎo)促炎程序性細胞死亡方式，主要表現(xiàn)形式為細胞腫脹裂解并且釋放大量促炎因子。而Caspase-1 活化需要NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor family, Pyrin domain containing protein 3, NLRP3）炎性小體誘導(dǎo)。目前提出NLRP3 炎癥小體的重要作用表現(xiàn)在調(diào)節(jié)腸道炎性反應(yīng)、識別腸道共生菌、維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面，NLRP3 炎癥小體失調(diào)對UC 的發(fā)病起到一定作用[3]。本研究通過觀察Caspase-1 信號通路介導(dǎo)細胞焦亡相關(guān)因子在UC 患者結(jié)腸黏膜中變化，旨在探討UC 可能發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)潛在治療新靶點?，F(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月—2019 年6 月在南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院門診診治UC 患者80 例作為UC 組。根據(jù)患者腸黏膜病理分級將UC 組分別劃為Ⅰ級組、Ⅱ級組和Ⅲ級組。納入標準：①經(jīng)內(nèi)鏡病理確診的UC[4]；②簽署知情同意書。排除主要指標：感染性結(jié)腸炎；合并其他重要臟器嚴重疾??；哺乳及妊娠期婦女；藥物過敏者。其中男性39 例，女性41 例，平均年齡（40.62±6.18）歲，平均病程（4.15±2.73）年。選擇同時期內(nèi)健康體檢者或者是結(jié)腸單發(fā)息肉切除術(shù)后復(fù)查內(nèi)鏡為正常者作為對照組40名，男性24名，女性16名，平均年齡（38.69±7.25）歲。

1.2 標本采集

在患者病變最為明顯腸段黏膜潰瘍邊緣或充血水腫最明顯處多點取材（6 ～8 個點）。正常對照組都是在乙狀結(jié)腸處取材（6 ～8 個點）。活檢組織一部分通過10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE 染色，觀察組織學(xué)形態(tài)并進行病理分級。另一部分檢標本放入液氮冷凍，備檢。

1.3 評價標準

UC 患者組織切片均是通過病理科2 位經(jīng)培訓(xùn)且取得相關(guān)資格認證的醫(yī)師閱片，按Truelove-Richards 標準[5]進行病理學(xué)分級。Ⅰ級：沒有顯著炎癥；Ⅱ級：輕至中度炎癥；Ⅲ級：重度炎癥。采用Southerland 疾病活動指數(shù)（Mayo 指數(shù)）評分系統(tǒng)[6]評估UC 疾病活動性，進行疾病分期。

1.4 相關(guān)因子檢測

將活檢組織制成組織勻漿，取上清。采用Western blot 檢測NLRP3、Caspase-1 在腸黏膜表達。采用ELISA法檢測白介素1β（interleukin-1 β, IL-1β）、白介素18（interleukin-18, IL-18）在腸黏膜表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；相關(guān)分析采用Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 UC 組患者結(jié)腸黏膜組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達

UC 組結(jié)腸黏膜組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達水平與正常對照組比較來看均明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。UC 結(jié)腸黏膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達跟隨組織病理分級增高從而逐步增強，Ⅲ級＞Ⅱ級＞Ⅰ級，組間方差分析表明，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組結(jié)腸黏膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達及和組織病理分級比較（± s）

表1 各組結(jié)腸黏膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達及和組織病理分級比較（± s）

組別 例數(shù)NLRP3Caspase-1觀察組Ⅰ級組 240.52±0.080.51±0.07Ⅱ級組 401.07±0.091.04±0.09Ⅲ級組 161.63±0.181.58±0.15對照組400.52±0.080.59±0.07 P＜0.05＜0.05組別 例數(shù)IL-1β/（pg·mL-1）IL-18/（pg·mL-1）觀察組Ⅰ級組 2428.47±8.06151.32±21.08Ⅱ級組 4046.15±8.82257.16±34.29Ⅲ級組 1675.24±9.15427.69±61.74對照組4022.17±5.03136.85±11.62 P＜0.05＜0.05

2.2 相關(guān)性分析

Spearman 秩相關(guān)分析顯示，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達與Mayo 評分均存在正相關(guān)關(guān)系，r值分別為0.706、0.712、0.867、0.836；（P＜0.05）。

3.討論

UC 是一種復(fù)雜的、由多種因素引起的疾病，其特征為可能涉及整個腸道慢性、復(fù)發(fā)性、進行性炎癥；盡管該病病因仍然不明確，目前認為個人遺傳易感性、外部環(huán)境、內(nèi)部腸道微生物群、宿主免疫應(yīng)答在內(nèi)等因素是造成UC 發(fā)病的主要原因，而有證據(jù)表明UC 可能由遺傳易感個體對腸道微生物群的異常和持續(xù)免疫反應(yīng)造成[7]。細胞焦亡已被研究證明，是一種新發(fā)現(xiàn)的、由Caspase-1介導(dǎo)的細胞程序性死亡方式，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分為兩種，一種為Caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典通路；和Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導(dǎo)的非經(jīng)典通路；細胞焦亡的特點是質(zhì)膜快速破裂，然后釋放出細胞內(nèi)容物和大量促炎物質(zhì)，進而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而造成細胞的損傷[8]。細胞焦亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種炎癥相關(guān)的細胞程序性死亡形式，過程伴隨細胞的脹破，細胞內(nèi)促炎物質(zhì)的排出，進而引發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)。細胞焦亡、細胞凋亡以及程序性壞死等形式共同調(diào)節(jié)細胞死亡過程，有研究表明，細胞焦亡參與過敏性疾病、感染性疾病、動脈粥樣硬化、痛風等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。NLRP3 炎癥小體主要功能活化Pro-Caspase-1，使其具有酶活性，激活Caspase-1 對促炎細胞因子IL-1β 和IL-18 前體進行加工，促使其成熟并釋放到細胞外，從而發(fā)揮促炎作用[10]。

細胞焦亡過程需要活化Caspase-1，而Caspase-1一個主要作用是介導(dǎo)IL-1β 前體裂解成具有活性IL-1β，其功能為募集、激活機體免疫細胞，促進趨化因子、炎癥因子、黏附分子等合成，最終形成“瀑布效應(yīng)”“級聯(lián)效應(yīng)”，從而引起劇烈炎癥反應(yīng)[11]。由此，細胞焦亡一定會引起機體炎癥反應(yīng)，細胞焦亡水平一定程度上反映機體炎癥反應(yīng)水平，兩者相互聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，UC 腸黏膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達均上調(diào)，并隨UC 病理分級升高而表達升高，提示炎癥越重，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達越強。同時，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 與UC 患者Mayo 評分呈正相關(guān)關(guān)系，提示UC 疾病活動度越高，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達越強，與文獻報道一致[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用NLRP3 依賴的pro-Caspase-1、IL-1b 和IL-18 的抑制劑Fclla-2 治療小鼠，能夠減輕急性結(jié)腸炎[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，將野生型（WT）C57BL/6 小鼠與NLRP3 基因敲除純合子C57BL/6小鼠給予DSS 誘導(dǎo)，比較各組腸道黏膜組織病理評分、NLRP3 炎癥小體及閉鎖小帶蛋白-1、閉鎖蛋白水平、IL-1β、及IL-18 水平、血清中二胺氧化酶及D-乳酸水平的差異，研究發(fā)現(xiàn)：敲除NLRP3 基因?qū)SS 誘導(dǎo)的小鼠UC 具有保護作用，其能改善腸道黏膜屏障功能和改善腸道黏膜組織病理[14]。此外，還有研究表明NLRP3 炎癥小體對TNF-α、IFN-γ、IL-10、TGF-β、干擾素誘導(dǎo)蛋白10、髓過氧化物酶、β-防御素和腸道菌群均有影響[15]。有研究表明，NLRP3 炎癥小體的活化與UC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，NLRP3 炎癥小體活化的治療方案可能是防治UC 的有效手段[16]。值得注意的是，中草藥中一些有效成分，如黃酮類、萜類、生物堿類等，同樣具有抗UC 的作用，其具有多通路、多靶點的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤的作用，且其優(yōu)勢在于來源廣泛、不良反應(yīng)小、療效確切等?；颊叩囊缽男暂^高、并且復(fù)發(fā)率低，能減少患者對藥物的依賴，提高患者生活質(zhì)量，故深入研究中藥調(diào)控NLRP3 炎癥小體的作用機制，可能為防治UC 提供新的方式和方法[17]。

綜上所述，UC 腸黏膜中Caspase-1 信號通路介導(dǎo)細胞焦亡相關(guān)因子表達均上調(diào)，并隨UC 病理分級的升高而表達增強。Caspase-1 介導(dǎo)細胞焦亡可能在UC 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，推測該作用通過NLRP3 炎癥小體激活Caspase-1 介導(dǎo)細胞焦亡，進而增加IL-1β、IL-18、IL-17 分泌而實現(xiàn)，未來可能成為UC 治療作用靶點。