包蟲病特異性抗體檢測試劑盒診斷效能評價及結(jié)果判定優(yōu)化

楊柳瑩 陳曦陽 凌 攀 楊 燁 孫 黎

(1.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都 610023)

包蟲病是棘球蚴寄生于人體和動物組織所致的寄生蟲病，主要以肝臟占位病變?yōu)橹鳎部衫奂胺?、脾、腎等多個器官。該病對人類的危害性大，早發(fā)現(xiàn)易治療，晚期致死率較高(中國醫(yī)師協(xié)會外科醫(yī)師分會包蟲病外科專業(yè)委員會，2019)。由于該病早期癥狀不明顯，臨床上容易誤診漏診。無創(chuàng)傷輔助檢查主要以影像學(xué)確認其特征性病灶為依據(jù)，但該方法不能發(fā)現(xiàn)早期感染患者且因部分包塊影像缺乏特異性，與腫瘤等病灶相似而難以區(qū)分(陳剛等，2000；戴季蓬等，2011；Zhangetal., 2012；閣文心等，2020)。人體感染包蟲后，相應(yīng)特異性抗體的產(chǎn)生成為最早出現(xiàn)的診斷依據(jù)。因此，免疫學(xué)診斷可彌補影像學(xué)檢查的缺陷，在包蟲病早期診斷、篩查無癥狀感染患者、復(fù)雜疑難疾病治療如手術(shù)病人術(shù)前風(fēng)險評估中具有較為重要的臨床參考價值(陳小林等，2011；Tameretal，2015)。

目前，國內(nèi)大多數(shù)包蟲病特異性IgG抗體診斷試劑盒還處于科研階段，僅有3個廠家的試劑盒在2011年后依次得到國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)的批準(zhǔn)予以上市。各廠家選用的特異性抗原、制備試劑的工藝流程均有一定區(qū)別，其檢測性能也有所差異，因此本文為了解目前市面上包蟲病試劑盒的診斷水平，對該3種試劑盒臨床診斷效能進行評價，以期為包蟲病臨床診斷提供試劑盒檢測結(jié)果優(yōu)化判定的策略。

1 材料與方法

1.1 試劑

包蟲病抗體診斷試劑盒(新疆貝斯明DIGFA，批號：20200307；上海新吉而GICA，批號：20200523；珠海海泰ELISA，批號：20200406)。

1.2 標(biāo)本來源

收集2010年至今四川省疾病預(yù)防控制中心門診就診病人血清。囊型包蟲病人血清69份和泡型包蟲病人血清18份，排除囊型泡型包蟲混合型感染病例。四川省進藏援建排查人員血清25份。影像呈占位性病變經(jīng)診斷排除包蟲感染者25份，其中18份為肝占位病人血清。寄生蟲?？颇蚁x確診病人血清10份，排除包蟲囊蟲混合感染病例。肝吸蟲、肺吸蟲、血吸蟲病人血清各6份。

1.3 方法及結(jié)果判定

采用3種試劑盒嚴格按照SOP進行操作，同時檢測所有樣本血清，并記錄結(jié)果。具體檢測方法及結(jié)果判定規(guī)則見參考文獻(房彬彬等，2019；龐華勝等，2019)。為優(yōu)化檢測效能，提高方法的特異度。本研究將DIGFA法的檢測結(jié)果劃分為6級，出現(xiàn)對某種抗原呈反應(yīng)性時相應(yīng)檢測點顯色：0級為對4種抗原均無反應(yīng)性，1級為對EgCF或EgP中一個抗原呈反應(yīng)性，2級為對EgCF和EgP兩種抗原呈反應(yīng)性，3級為對其中兩種抗原呈反應(yīng)性且其中一種必為EgB或Em2，4級為對任意3種抗原呈反應(yīng)性，5級為對4種抗原均呈反應(yīng)性。將GICA法的檢測結(jié)果劃分為6級：0級為檢測線1無色(-)，1級為有隱約痕跡(±)，2級為淺紅色(+)，3級為紅色(++)， 4級為深紅色(+++)， 5級為紫紅色(++++) 通過ROC曲線對檢測結(jié)果進行分析，并尋找最佳診斷界值。采用DIGFA法對ELISA法或GICA法所得檢測結(jié)果低于相應(yīng)最佳診斷界值的陽性樣本進行重新測定，以DIGFA法最佳診斷界值為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，比較結(jié)果優(yōu)化前后檢測效能指標(biāo)差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用Kappa值進行一致性評價；通過ROC曲線進行試劑盒診斷效能評價，確定最佳診斷界值。

2 結(jié)果

2.1 3種包蟲病抗體檢測試劑盒針對相同樣本的檢測結(jié)果

各試劑盒針對包蟲病人血清樣本的檢測結(jié)果存在漏檢。各類非包蟲病排查人群均出現(xiàn)包蟲病抗體假陽性結(jié)果，在囊蟲病人血清中的包蟲病抗體假陽性率最高，在其他不同人群中包蟲病抗體假陽性率無規(guī)律可循。結(jié)果詳見表1。

2.2 膠體金法針對兩型包蟲病的鑒別能力

3種試劑盒中只有使用膠體金法的兩種試劑盒具有判別囊型、泡型包蟲病的能力。DIGFA法用于檢測的4種抗原中，EgB或Em2單抗原對包蟲病的敏感度明顯低于EgCF或EgP抗原。Em2和EgB抗原檢測點同時呈反應(yīng)性共43例，兩抗原對包蟲病人血清敏感度僅為74.7%(65/87)，低于該試劑盒對所有包蟲病人血清的敏感度90.8%，且存在假陽性結(jié)果。GICA法HCF和rEm18抗原檢測線同時呈反應(yīng)性共15例。針對檢測泡型包蟲病的rEm18抗原敏感度為94.5%，特異度為100%。結(jié)果詳見表2、3。

表1 不同組病例3種包蟲病抗體診斷試劑盒對應(yīng)的檢測結(jié)果Tab.1 Results of the three kinds diagnostic kits for echinococcosis antibody in different human groups

表2 2種膠體金法包蟲病抗體試劑盒鑒別兩型包蟲病診斷效能比較Tab.2 Diagnostic efficacy of two colloidal gold antibody kits for two echinococcosis

表3 DIGFA法各抗原包蟲病檢測效能比較Tab.3 Detection efficacy of echinococcosis antigens by DIGFA

2.3 ROC曲線尋找各法最佳診斷界值

ROC曲線所得最佳診斷界值即各曲線上離坐標(biāo)軸上點(0.0,1.0)最近時所對應(yīng)的值。GICA.DIGFA.ELISA法所獲得ROC曲線見圖1，ROC曲線下面積分別為0.938、0.901、0.945，試劑診斷準(zhǔn)確性較高，0.9

圖1 3種診斷方法檢測數(shù)據(jù)所對應(yīng)的ROC曲線Fig.1 ROC curves corresponding to the data detected by three diagnostic methods

2.4 方法優(yōu)化前后檢測效能比較

3種檢測方法中GICA法的靈敏度最佳為94.3%，ELISA法的特異度最好僅為83.3%。Kappa值顯示3種方法診斷結(jié)果的一致性水平均為“好”，0.6

表4 三種診斷方法最佳診斷界值對應(yīng)的檢測效能Tab.4 Detection efficacy corresponding to the best diagnostic cutoff values of three diagnostic methods

表5 優(yōu)化前后的檢測效能Tab.5 Improved detection efficacy after optimization

3 討論

包蟲病屬于地方病，在我國患病率并不高(Zhangetal., 2015)，就診排查人群中絕大部分為非包蟲病人。本中心不僅對疑似包蟲病的患者進行檢查，近年來還承接各政府部門派遣至藏區(qū)工作至少1年以上人員的包蟲病排查工作(鄧銀等，2020)。篩查對象不斷增加，而最終確診人數(shù)較少，方法特異度差引起的誤診給病人帶來心理負擔(dān)以及藥物對身體的傷害，造成醫(yī)療資源的浪費?？贵w篩查作為包蟲病輔助診斷的重要一環(huán)，使用敏感度強、特異度高的診斷試劑，實現(xiàn)盡早發(fā)現(xiàn)病人，減少不必要的診療具有重要的意義。

各方法的診斷效能指標(biāo)均表現(xiàn)良好，僅特異度不理想，因此本室通過ROC曲線尋找各法的最佳診斷界值，發(fā)現(xiàn)其均高于試劑盒的cutoff值，該界值對應(yīng)的靈敏度在81.6%～83.9%之間，特異度在89.7%～92.3%之間。在日常檢測工作中發(fā)現(xiàn)，通過ELISA法或GICA法檢測到的假陽性樣本中，反應(yīng)性較弱的樣本血清通過DIGFA法檢測僅出現(xiàn)其中1～2個檢測點顯色的情況較多。而包蟲病人血清即使ELISA法或GICA法檢測結(jié)果為弱陽性，DIGFA法也可能出現(xiàn)2個以上檢測點顯色。由此推測包蟲病人血清即使抗體濃度不高也可呈現(xiàn)幾種抗原同時陽性，而非包蟲病人引起的假陽性反應(yīng)通常在較強時才會出現(xiàn)幾種抗原同時陽性。3種方法假陽性結(jié)果中，一致性為63.16%(12/19)，重復(fù)性較高。經(jīng)以上觀察進行權(quán)衡分析，本文對結(jié)果判定進行優(yōu)化，特異度得到改善，結(jié)果令人滿意。需注意的是GICA法檢測泡型包蟲病準(zhǔn)確度已達較高水平，使用該法判定為泡型包蟲病的結(jié)果不需要結(jié)果優(yōu)化。

在包蟲病分型鑒別診斷中，DIGFA法并不能將檢測為陽性結(jié)果的所有包蟲病人血清進行分型。泡型包蟲病假陽性結(jié)果中，有2例囊型包蟲病人血清Em2抗原反應(yīng)性強于EgB抗原，這與付艷等研究吻合：個別多子囊型包蟲病人對Em2抗原反應(yīng)性強于EgB抗原(付艷等，2000)。因此Em2反應(yīng)性強于EgB抗原時，不能排除囊型包蟲病的可能。GICA法能對所有檢測為陽性結(jié)果的包蟲病人血清進行分型，且無泡型包蟲病假陽性病例，不存在泡型包蟲病的誤判。在分型鑒別診斷上，兩法靈敏度相差較大，GICA法明顯優(yōu)于DIGFA法。

在檢測方法的選擇方面，由于ELISA法不能對包蟲病分型，但具有批量檢測的優(yōu)勢，可通過儀器自動化檢測，人為干擾因素少，且樣本檢測單價相對低廉，適于規(guī)模性寄生蟲病體檢篩查。而GICA法能對包蟲病分型，操作簡單、耗時短，對實驗室儀器設(shè)備要求低，但結(jié)果判斷僅憑肉眼觀測，易受人為干預(yù)，需有經(jīng)驗的檢測人員進行判別，且試劑盒價格相對偏高，更適用于醫(yī)院零散病人的檢測。因此，對于不需分型的包蟲病篩查，可選用ELISA法。若需分型診斷，則最好選用GICA 法。對于上述兩法檢測結(jié)果介于最佳診斷界值與cutoff之間的樣本聯(lián)合DIGFA法綜合判定?？紤]到成本效益最大化，工作中不可能對所有病例均進行多試劑同時檢測，本研究通過ROC曲線確定的最佳診斷界值，篩選出特定的血清抗體反應(yīng)性較弱人群采用雙試劑盒檢測，有效控制成本，可進一步排除其中的假陽性結(jié)果，相比于單試劑檢測具有更佳的檢測效能。

目前市售試劑盒存在的優(yōu)缺點主要體現(xiàn)為：GICA法檢測泡型包蟲病人血清抗體使用的rEm18抗原為重組抗原，不易受非目標(biāo)物質(zhì)干擾。而3種方法使用的其他抗原均為純化的細粒棘球蚴抗原，易受非目標(biāo)物質(zhì)干擾，特別是因為與其他蠕蟲類寄生蟲擁有共同的抗原成分的問題，導(dǎo)致與囊蟲病人較為嚴重的交叉反應(yīng)(仝德勝等，2013；陳闖等，2017)；DIGFA法各單抗原檢測抗體的靈敏度相對偏低，聯(lián)合多種抗原檢測抗體增加了試劑的靈敏度，但特異度有所下降；由于囊型或泡型包蟲病人陽性血清對兩種膠體金法使用的抗原均存在交叉反應(yīng)，故不能明確患者是否被囊型和泡型包蟲混合感染，這與龐華勝等人的報道一致(龐華勝等，2019)。綜合以上信息，研制高純度的重組抗原是今后試劑盒改良的主要方向。如何更好地結(jié)合抗體濃度與種類來綜合判定結(jié)果也是提高試劑盒檢測效能的方法之一。解決各特異性抗原與陽性血清之間的交叉反應(yīng)這一難題可減少分型診斷的誤判，更能為囊型和泡型包蟲病混合感染病例的確診提供依據(jù)。