基于高通量測(cè)序的植入前遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)在1例染色體平衡易位家系中的應(yīng)用

何軼群 何天文 盧建

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511400）

染色體平衡易位是2條不同源的染色體各發(fā)生斷裂后，互相變位重接而形成兩條結(jié)構(gòu)上重排的染色體。這種易位大多數(shù)都保留了原有基因總數(shù)，對(duì)基因作用和個(gè)人發(fā)育一般無嚴(yán)重影響，通常易位攜帶者表型正常。平衡易位人群攜帶頻率約為0.2%，不孕夫婦約為0.6%，復(fù)發(fā)流產(chǎn)夫婦約為9.2%［1］。植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）是胚胎植入前檢測(cè)胚胎染色體的整倍性和基因組染色體拷貝數(shù)的變異。基于高通量測(cè)序的PGT技術(shù)，以大規(guī)模并行序列為特征，一次性完成幾十萬到幾百萬條的DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序。通過囊胚活檢獲得5～8個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，經(jīng)全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA），高通量測(cè)序和生信分析，可篩選出染色體正常／平衡易位攜帶者的整倍體囊胚，減少流產(chǎn)發(fā)生和出生缺陷。本研究運(yùn)用基于高通量測(cè)序的PGT技術(shù)對(duì)1例染色體平衡易位家系的胚胎染色體進(jìn)行分析，并探討了染色體平衡易位夫婦的胚胎整倍體率和形成機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 患者，女，29歲，G1P0A1，既往自然流產(chǎn)1次，不孕7＋年，女方HPV 12型（＋），雙側(cè)卵巢多囊改變，男方精液檢查提示：弱精子癥；女方染色體核型提示：46，XX（未見異常），男方染色體核型提示：46，XY，t（1；12）（p32；q24.3）。夫婦二人于2020年1月來廣東省婦幼保健院進(jìn)行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVFET）治療。卵泡期長(zhǎng)方案促排獲卵20枚，卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精獲獲得囊胚15個(gè)，活檢10個(gè)。依據(jù)Garnder囊胚分級(jí)法分級(jí)，1號(hào)胚胎為B／4ab，2～7號(hào)胚胎為B／4bb，8～9號(hào)胚胎為B／6bb，10號(hào)胚胎為B／5bc。高通量測(cè)序結(jié)果提示：6枚整倍體囊胚，4枚非整倍體囊胚。移植1枚B／4bb整倍體囊胚，移植12d后血清HCG 661.6IU／ml，移植28d超聲提示：宮內(nèi)單活胎。唐氏篩查提示：臨界風(fēng)險(xiǎn)，21-三體風(fēng)險(xiǎn)值1∶318。胎兒頸項(xiàng)透明層厚度（nuchal translucency，NT）提示：1.6mm。羊水染色體核型提示：46，XN（未見異常核型），羊水染色體微陣列提示：（-），羊水定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR）提示：（-）。胎兒足月后，順產(chǎn)1男嬰，體重3.41kg，發(fā)育正常。

1.2 方法

1.2.1 IVF和囊胚培養(yǎng) 在夫妻雙方簽署知情同意書后，采用卵泡期長(zhǎng)方案，月經(jīng)第2d注射達(dá)菲林降調(diào)節(jié)，30d后注射果納芬針促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，當(dāng)3個(gè)以上卵泡直徑≥18mm時(shí)，肌注HCG，36h后取卵。通過ICSI受精，將受精胚胎培養(yǎng)5d或6d后，使用摩擦解剖法進(jìn)行囊胚活檢5～8個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，放置聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中，-20℃儲(chǔ)存，待WGA。

1.2.2 WGA和高通量測(cè)序分析 通過Sureplex擴(kuò)增試劑盒對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行WGA。構(gòu)建文庫，使用胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)序。通過MiSeq平臺(tái)進(jìn)行胚胎文庫的大規(guī)模高通量平行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)采用平均值算法，對(duì)基因組染色體進(jìn)行連續(xù)窗口劃分，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本每個(gè)窗口內(nèi)的DNA序列片段數(shù)目，使用PGXcloud進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

經(jīng)測(cè)序數(shù)據(jù)分析，提示該夫婦共獲6個(gè)整倍體囊胚，4個(gè)非整倍體囊胚，其中1號(hào)和9號(hào)胚胎染色體結(jié)果為46，XN，-（1）（p36.33-p32.3）（52.91Mb），＋（12）（q24.32-q24.33）（5.68Mb），6號(hào)胚胎染色體結(jié)果為47，XN，＋1，8號(hào)胚胎染色體結(jié)果為46，XN，-（5）（p15.33-p13.2）（37.97Mb），＋（mosaic）（9）（32%），其他6個(gè)整倍體胚胎染色體結(jié)果為46，XN，共6個(gè)胚胎可供移植，詳見表1和圖1。

圖1 高通量測(cè)序的基因組變異圖譜

表1 10個(gè)囊胚染色體結(jié)果匯總表

3 討論

本例家系男方攜帶1號(hào)和12號(hào)染色體的平衡易位，女方染色體核型正常。理論上，染色體平衡易位攜帶者，其表型一般正常，可形成18種配子，若其配偶染色體正常，子代中1／18為正常染色體核型，1／18為與受檢者相同類型的平衡易位攜帶者，其余16／18的染色體核型為單體或部分單體、三體或部分三體，易導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎或畸形兒。然而，該夫婦行染色體結(jié)構(gòu)重排的胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR）助孕后，獲得10個(gè)囊胚，其中6個(gè)為正常／平衡整倍體，且1號(hào)和12號(hào)易位染色體的完全正?；蚱胶庖孜粩y帶整倍體率高達(dá)70%（7／10），其易位染色體的整倍體率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于理論值1／9。Ko等［2］收集65對(duì)易位夫婦的1294個(gè)3天卵裂球胚胎，進(jìn)行減數(shù)分裂分離分析，通過2∶2分離獲得729個(gè)胚胎（56.3%），對(duì)位分離占21.8%，鄰位-1分離占23.4%，鄰位-2分離占7.0%。Ogilvie等［3］收集18對(duì)易位夫婦的149個(gè)3天的胚胎，減數(shù)分裂分離分析發(fā)現(xiàn)，47.7%為對(duì)位分離，24.8%為鄰位-1分離，10.1%為鄰位-2分離，15.4%為3∶1分離，2.0%為4∶0分離。Wang等［4］收集89對(duì)平衡易位夫婦，獲得378個(gè)5D或6D囊胚，對(duì)活檢囊胚的減數(shù)分裂分離方式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)女性攜帶者對(duì)位分離發(fā)生率為44.19%，男性攜帶者對(duì)位分離發(fā)生率為45.15%。Zhang等［5］收集356例易位夫婦的1842個(gè)囊胚，其中對(duì)位分離模式最常見（749／1842，40.7%），其次是鄰位-1（508／1842，27.6%）和鄰位-2（201／1842，10.9%）。由此可見，在囊胚中，平衡易位染色體，減數(shù)分離分離方式以2∶2的分離方式為主，其中以對(duì)位分離占主要，接近40%～50%。這表明同源著絲粒在細(xì)胞中向相對(duì)極遷移的趨勢(shì)是增強(qiáng)的。而這種對(duì)位分離的比例依然不能直接預(yù)測(cè)整倍體囊胚的比例。因?yàn)樵谂渥有纬傻倪^程中，有一定比例的染色體會(huì)發(fā)生其他新發(fā)的染色體變異，而且由于染色體相互效應(yīng)的影響，平衡易位攜帶者的囊胚新發(fā)異常率要大于染色體正常夫婦。Liu等［6］收集75對(duì)平衡易位夫婦的252個(gè)囊胚，平衡易位攜帶者整倍體胚胎率為27.8%，男性攜帶者的正常／平衡整倍體胚胎率高于女性攜帶者（42.4%vs.23.3%）。Lei等［7］收集了532對(duì)易位夫婦的3030個(gè)囊胚信息，其中874（28.8%）為整倍體，男性攜帶者整倍體胚胎率為30.68%；女性攜帶者整倍體胚胎率為27.20%，男性攜帶者D3胚胎率、囊胚形成率和囊胚整倍體率高于女性攜帶者。所以，平衡易位攜帶者實(shí)際產(chǎn)生正常或平衡易位的整倍體率，即可移植胚胎概率接近30%，而且男性易位攜帶者實(shí)際產(chǎn)生可移植胚胎概率高于女性易位攜帶者。這可能與ICSI技術(shù)使用有關(guān)，因?yàn)閮?yōu)先選擇了形態(tài)正常的精子，從而起到過濾作用。因此，在臨床咨詢中，我們不應(yīng)該只是簡(jiǎn)單地告知咨詢者平衡易位攜帶者整倍體配子的理論值，而應(yīng)該在大數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，以及患者的自身情況，綜合評(píng)估患者的生育風(fēng)險(xiǎn)。