大腸桿菌生產(chǎn)飼用氨基酸的研究進展

郭亮 ，高聰 ，柳亞迪 ，陳修來 ，劉立明

（1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2江南大學(xué)國際食品安全聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫214122）

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，人們對畜牧飼料蛋白的需求日益劇增。非洲豬瘟、瘋牛病目前沒有疫苗，倒逼養(yǎng)殖企業(yè)加強生物防控，減少甚至不用動物性蛋白，避免攜帶病毒［1］。眾所周知，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)實際上是由氨基酸提供，通過添加必要的氨基酸可以降低動物膳食中的粗蛋白水平，同時滿足動物營養(yǎng)需求［2-4］。在動物飼料中添加適宜含量的氨基酸，不僅可以最大限度地滿足動物的蛋白需求，調(diào)控動物的生長和飼料轉(zhuǎn)化率，而且大大降低粗蛋白用量，提高飼料利用率，節(jié)約飼養(yǎng)成本［5-8］。因此，研究人員發(fā)展了利用飼用氨基酸作為氨基酸添加劑，替代天然蛋白成分，生產(chǎn)配合飼料的方法。飼用氨基酸主要是指植物性飼料缺乏的必需氨基酸（如賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、蘇氨酸）和一些小品種氨基酸（如纈氨酸和精氨酸）［9-12］。目前飼用氨基酸的生產(chǎn)方法主要有3 種：動植物提取、化學(xué)煉制和生物煉制［13-14］。由于動植物提取的原料受限、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染大等缺點，在工業(yè)上未得到廣泛應(yīng)用［15-16］。化學(xué)煉制具有原料不可再生、反應(yīng)步驟多、伴有副反應(yīng)發(fā)生、反應(yīng)條件苛刻、安全性低差等問題，在實際生產(chǎn)中被逐漸淘汰［17］。依靠微生物為基礎(chǔ)的生物煉制，不僅利用可再生生物質(zhì)資源為原料，而且具有成本低廉、產(chǎn)品純度高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)勢，為解決動植物提取和化學(xué)煉制中的問題提供了一種有效解決方案，因而被廣泛應(yīng)用于飼用氨基酸生產(chǎn)［18-27］。

由于大腸桿菌遺傳背景清晰、生長迅速與培養(yǎng)簡單，成為了研究最為廣泛和深入的模式微生物［15，28］。利用合成生物學(xué)技術(shù)，改造大腸桿菌細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞工廠，利用生物質(zhì)為原料可綠色高效合成飼用氨基酸［20，29-34］。本文重點關(guān)注了賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸等飼用氨基酸的生物合成途徑，介紹了大腸桿菌合成飼用氨基酸的生產(chǎn)瓶頸，綜述了大腸桿菌細(xì)胞工廠合成飼用氨基酸的研究進展，并展望了未來飼用氨基酸菌株改造的重點方向。

1 天冬氨酸族氨基酸大腸桿菌細(xì)胞工廠

1.1 天冬氨酸族氨基酸的生物合成途徑

由于天冬氨酸是賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸共同前體，因此，將賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸統(tǒng)稱為天冬氨酸族氨基酸。賴氨酸具有增強動物食欲、增強抗病能力和促進外傷治愈的作用。賴氨酸是植物性飼料中最缺乏的一種氨基酸，分別是豬和禽類飼料的第一與第二限制性氨基酸；蘇氨酸是繼賴氨酸和甲硫氨酸之后家禽飼料中的第三限制性氨基酸；甲硫氨酸是家禽的第一限制性氨基酸，豬的第二限制性氨基酸［5-8］。

葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑形成的丙酮酸，經(jīng)羧化反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸在天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AAT）的作用下形成天冬氨酸［35］。如圖1所示，天冬氨酸經(jīng)天冬氨酸激酶（AK Ⅰ、AK Ⅱ或AK Ⅲ）和天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD）催化生成天冬氨酸半醛。天冬氨酸半醛，一方面經(jīng)過二氫吡啶二羧酸合酶（DS）、二氫吡啶二羧酸還原酶（DR）、四氫二吡啶琥珀酰酶（THS）、N-琥珀酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（SDAT Ⅰ、SDAT Ⅱ）、N-琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰酶（SDD）、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶（DE）與二氨基庚二酸脫羧酶（DDC）催化合成賴氨酸，另一方面天冬氨酸半醛經(jīng)高絲氨酸脫氫酶（HD Ⅰ、HD Ⅱ）脫羧形成高絲氨酸［3］。高絲氨酸經(jīng)高絲氨酸激酶（HK）和蘇氨酸合酶（TS）催化形成蘇氨酸［36-37］，經(jīng)O-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶（HST）、琥珀酰高絲氨酸裂解酶（SHL）、胱硫醚β-合成酶（CL）、半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT Ⅰ、HMT Ⅱ）催化形成甲硫氨酸［38-40］。

圖1 大腸桿菌天冬氨酸族氨基酸的合成路徑及其反饋調(diào)節(jié)示意圖Fig.1 Metabolic pathways of aspartate family amino acids and feedback regulations involved in E.coli

大腸桿菌細(xì)胞工廠合成天冬氨酸族氨基酸主要存在以下問題：①天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶受到反饋抑制和反饋阻遏，例如天冬氨酸激酶同工酶AK Ⅰ（thrA）、AK Ⅱ（metL）和AK Ⅲ（lysC）分別受蘇氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸反饋調(diào)節(jié)［35，41］；②從天冬氨酸合成 1 mol 蘇氨酸、1 mol 賴氨酸和1 mol 甲硫氨酸，分別需要3 mol、4 mol和3 mol的NADPH，在合成過程中可能導(dǎo)致還原力不平衡［35，42］；③大腸桿菌內(nèi)源的賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸的合成路徑之間，競爭代謝流，減弱了合成目標(biāo)化學(xué)品的代謝流［3］；④大腸桿菌存在本源賴氨酸和蘇氨酸的分解途徑，可能會分解賴氨酸和蘇氨酸［35］；⑤在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)合成的氨基酸如何有效分泌到胞外［35，43-46］。

1.2 賴氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

研究人員在E.coliΔmetΔthr（CCTCC M2013239）菌株中，過表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc）、吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（PntB）、天冬氨酸酶（AspA），構(gòu)建了合成賴氨酸的底盤微生物E. coliNT1003，在最優(yōu)發(fā)酵條件下賴氨酸產(chǎn)量為134.9 g/L，葡萄糖得率為45.4%［47］。近年來，圍繞大腸桿菌細(xì)胞工廠生產(chǎn)賴氨酸的研究工作集中在增加前體供應(yīng)［48］、解除賴氨酸對關(guān)鍵酶的反饋抑制［49］和適應(yīng)性進化等策略［50］。草酰乙酸是合成賴氨酸等天冬氨基酸族氨基酸的重要前體物質(zhì)，減少支路代謝消耗草酰乙酸的羧化反應(yīng)與增強合成草酰乙酸的羧化反應(yīng)，可以增加前體草酰乙酸的供應(yīng)［48，51］。例如，過表達(dá)大腸桿菌本源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc），增強合成草酰乙酸的羧化反應(yīng)，使賴氨酸的產(chǎn)量增加22.22%［48］。在大腸桿菌中引入谷氨酸棒桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc），同時敲除丙酮酸激酶（PykA 和PykF），實現(xiàn)了天冬氨酸的積累，在此基礎(chǔ)上，進一步敲除天冬氨酸氨裂解酶（AspA）和蘋果酸脫氫酶（Mdh），使賴氨酸前體天冬氨酸的積累量增加到6.95 mmol/L［51］。解除賴氨酸對關(guān)鍵酶的反饋抑制可以強化賴氨酸合成路徑效率。例如，通過比對谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌二氫吡啶二羧酸合酶（DS）的序列和結(jié)構(gòu)，將谷氨酸棒桿菌DS 抑制劑結(jié)合位點周圍的殘基，引入到大腸桿菌DS 中，減弱了賴氨酸對DS的反饋抑制，使賴氨酸得率增加45%［49］；通過將天冬氨酸激酶（AK Ⅲ，由lysC編碼）第344 位的氨基酸殘基由蘇氨酸（T）替換為甲硫氨酸（M），減弱了賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制，通過將二氫吡啶二羧酸合酶（DS，由dapA編碼）第56位的氨基酸殘基由組氨酸（H）替換為賴氨酸（K），減弱了賴氨酸對DS 的反饋抑制，將突變體lysCT334M和dapAH56K引入到工程菌E. coliLATR11（E. coliMG1655 衍生菌株）中，使賴氨酸的產(chǎn)量增加了63%［48］。適應(yīng)性進化是指微生物種群在一定選擇壓力條件下不斷進化，從而獲得理想表型的方法［52］。為了進一步提高大腸桿菌細(xì)胞工廠賴氨酸的生產(chǎn)性能，Wang 等［50］利用突變的 DNA 聚合酶校對元件（DnaQ），搭建了一個基因組復(fù)制工程輔助連續(xù)進化系統(tǒng)（GREACE），使隨機突變率提高了317 倍。并利用GREACE 技術(shù)，篩選到突變體E.coliRS3，使賴氨酸產(chǎn)量提高了14.8%，增加到155 g/L。利用代謝組學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)，對突變菌株E.coliRS3進行分析，發(fā)現(xiàn)突變菌株主要通過瓜丁胺酶（SpeBA302V）、 ATP 合酶亞基（AtpBS165N）和前蛋白轉(zhuǎn)位酶（SecYM145V）的突變，改善細(xì)胞在應(yīng)激條件下的完整性和強化賴氨酸合成的代謝通量。本研究團隊［53］在前期誘變育種獲得賴氨酸生產(chǎn)菌株E.coliCCTCC M2019435的基礎(chǔ)上，基于酶約束模型ec_iML1515，預(yù)測出20 個合成賴氨酸的關(guān)鍵靶點（靶點分布在前體物質(zhì)積累、產(chǎn)物合成路徑強化和能量供給）。并通過實驗對靶點進行篩選，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)二氫硫辛酰胺脫氫酶、黃素還原酶、乙酰輔酶A合成酶、二氨基二甲酸脫羧酶、天冬氨酸激酶，使賴氨酸產(chǎn)量分別提高了63.8%、108.7%、55.6%、50.0%和123.6%。在此基礎(chǔ)上，利用動態(tài)FBA 的模擬，將發(fā)酵周期縮短了47.7%，使賴氨酸產(chǎn)量增加至193.6 g/L（表1）。

1.3 蘇氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

研究人員在篩選得到E.coliTWF001（CCTCC M2017730）菌株中，通過敲除轉(zhuǎn)錄因子IclR，在基因組上用trc啟動子強化異檸檬酸裂解酶（AceB）、蘋果酸合酶（AceA）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AspC）的表達(dá)，獲得合成蘇氨酸的底盤微生物E. coliTWF006，使蘇氨酸的產(chǎn)量增加到12.1 g/L［41］。為了進一步提高蘇氨酸的產(chǎn)量，發(fā)展了強化蘇氨酸合成路徑［41］、阻斷冗余代謝支路［54，71］和輔因子工程［55］等策略。例如，在E.coliTWF006中過表達(dá)高絲氨酸激酶（ThrB）、蘇氨酸合酶（ThrC）、天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD）和抗反饋調(diào)節(jié)的天冬氨酸激酶（ThrA），強化蘇氨酸合成路徑，使蘇氨酸產(chǎn)量增加了31%，達(dá)到15.85 g/L［41］。張雪等［54］將天冬氨酸激酶（ThrA）第345位的色氨酸殘基突變?yōu)楸奖彼釟埢?，解除了蘇氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制，使蘇氨酸的產(chǎn)量增加了2.56 倍。在蘇氨酸合成路徑中，阻斷冗余代謝支路包括敲除lysA（二氨基庚二酸脫羧酶編碼基因），阻斷賴氨酸的合成；敲除metA（O-高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因），阻斷甲硫氨酸的合成；敲除tdh（蘇氨酸脫氫酶編碼基因），阻斷蘇氨酸向甘氨酸轉(zhuǎn)化；將ilvA（蘇氨酸脫水酶編碼基因）的第290 位堿基由C 替換為T，降低蘇氨酸脫水酶催化活性減少蘇氨酸向異亮氨酸的轉(zhuǎn)化［71］。輔因子工程策略可以改善蘇氨酸合成過程中NADPH 的供給，維持高效的代謝合成路徑。例如，Li 等［55］在E.coliTHRD（TCCC 11825）發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)甜菜堿通過促進6-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因（zwf）的轉(zhuǎn)錄，增加了6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，強化輔因子NADPH 的供給，使蘇氨酸產(chǎn)量增加13.3%，達(dá)到117.1 g/L。此外，研究人員還提出了平衡代謝流分配策略［36］和兩階段調(diào)控策略［56］，改善蘇氨酸生產(chǎn)。Fang等［36］在工程菌E. coliTWF001 中，利用溫度敏感性調(diào)控元件和阻遏蛋白，建立了溫控調(diào)節(jié)開關(guān)，調(diào)控丙酮酸羧化酶（PYC）的表達(dá)，實現(xiàn)碳流在丙酮酸和草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)換。在發(fā)酵前期，將溫度控制在37 ℃，關(guān)閉PYC 表達(dá)，使碳流充分進入TCA 循環(huán)用于生長；在發(fā)酵后期，將溫度提高到42 ℃，開啟PYC 表達(dá)，讓丙酮酸經(jīng)PYC 羧化合成草酰乙酸合成蘇氨酸，使蘇氨酸對葡萄糖的得率達(dá)到 124.03%。Liu 等［56］將工程菌E.coliTHRD 的發(fā)酵過程分為細(xì)胞生長階段和產(chǎn)物合成階段，并利用基因開關(guān)實現(xiàn)工程菌兩階段轉(zhuǎn)換。在細(xì)胞生長階段，過表達(dá)丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶與檸檬酸合成酶，增加糖酵解途徑到TCA 途徑的碳通量，從而增加葡萄糖利用和改善細(xì)胞生長。在產(chǎn)物合成階段，通過基因開關(guān)將碳流導(dǎo)向蘇氨酸合成路徑，同時表達(dá)谷氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，構(gòu)建谷氨酸和NADPH 再生成系統(tǒng)，為蘇氨酸合成提供底物和輔因子，最終使蘇氨酸產(chǎn)量增加了2.02倍（表1）。

表1 大腸桿菌細(xì)胞工廠生產(chǎn)飼用氨基酸進展比較Tab.1 Comparison of feed amino acid production by E.coli cell factories

1.4 甲硫氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

Huang 等［38］以 W3110 為出發(fā)菌株，通過敲除負(fù)轉(zhuǎn)錄因子（MetJ），過表達(dá)O-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶（MetA）和甲硫氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（YjeH），構(gòu)建了合成413.16 mg/L 甲硫氨酸的底盤微生物W3110 ΔmetJ/pTrcA*H。在甲硫氨酸生物合成途徑中，甲硫氨酸的C4骨架、硫和甲基分別由O-琥珀酰高絲氨酸、半胱氨酸與甲基四氫葉酸提供。因此，強化甲硫氨酸前體供應(yīng)，可以提高甲硫氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能，例如可以通過上調(diào)O-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶、解除甲硫氨酸的反饋調(diào)節(jié)、阻斷賴氨酸與蘇氨酸的支路代謝，增強 C4骨架O-琥珀酰高絲氨酸的供應(yīng)［38，57］；通過硫源優(yōu)化，可以強化硫供體半胱氨酸的供應(yīng)［38］；通過敲除purU或者外源添加甘氨酸，可以增加甲基供體甲基四氫葉酸的供應(yīng)［57］。Tang等［57］在工程菌E. coliW3110 IJAHFEBC（W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC）中，過表達(dá)O-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，增加O-琥珀酰高絲氨酸的供應(yīng)，使甲硫氨酸的產(chǎn)量從2.8 g/L 增加到3.22 g/L。同時，在發(fā)酵過程中添加甲基供體甘氨酸，使甲硫氨酸的產(chǎn)量增加到3.96 g/L。 Huang 等［38］在 工 程 菌E. coliW3110 ΔmetJ/pTrcA*H 中，敲除轉(zhuǎn)錄因子metI阻斷甲硫氨酸內(nèi)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)MetD，使甲硫氨酸的產(chǎn)量增加43.65%。同時，敲除二氨基庚二酸脫羧酶編碼基因（lysA）阻斷賴氨酸合成路徑，使甲硫氨酸的產(chǎn)量增加8.5倍。在此基礎(chǔ)上，通過外源添加Na2S2O3增加硫的供應(yīng)，使甲硫氨酸的產(chǎn)量增加11.45%，再通過發(fā)酵工藝優(yōu)化使甲硫氨酸的產(chǎn)量進一步增加到 9.75 g/L。Li 等［58］以 W3110 為出發(fā)菌株，通過敲除二氨基庚二酸脫羧酶編碼基因（lysA）、高絲氨酸激酶編碼基因（thrB）、蘇氨酸合酶編碼基因（thrC），阻斷甲硫氨酸的競爭代謝路徑。然后，敲除負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子編碼基因（metJ），下調(diào)甲硫氨酸抑制因子編碼基因（metK）的表達(dá)，并利用pN25 啟動子強化琥珀酰高絲氨酸裂解酶（MetB）的表達(dá)，強化甲硫氨酸合成路徑，獲得工程菌E. coliMe05，在此基礎(chǔ)上，過表達(dá)甲硫氨酸合酶（MetE 和MetH）和5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MetF），獲得合成甲硫氨酸的工程菌E.coliMe05（pETMAFbr-B-Y/pKKmetH），使甲硫氨酸的產(chǎn)量增加到5.62 g/L。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)僅僅依靠單因素疊加調(diào)控，無法實現(xiàn)甲硫氨酸代謝通量的最大化，基于模塊組合的多層次調(diào)控策略可能更具合理性，例如 Huang 等［39］首先，采用 CRISPRi 技術(shù)，對合成甲硫氨酸底盤微生物的中心代謝路徑和氨基酸合成路徑中80 個靶點基因進行調(diào)控，獲得控制甲硫氨酸合成的關(guān)鍵靶點。然后，根據(jù)甲硫氨酸生物合成的復(fù)雜性和多層次性，提出了基于分支途徑功能的模塊化策略，將甲硫氨酸生物合成路徑分為碳模塊、硫模塊和一碳模塊。并利用篩選到的關(guān)鍵靶點對這些模塊進行調(diào)控，逐步提升甲硫氨酸的產(chǎn)量，最終使甲硫氨酸的產(chǎn)量增加到16.86 g/L（表1）。

2 色氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠

2.1 色氨酸的生物合成途徑

作為一種必需氨基酸，L-色氨酸在人類與動物的生長發(fā)育過程中起著重要作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥與飼料添加劑等領(lǐng)域。色氨酸具有特殊的結(jié)構(gòu)，其代謝產(chǎn)物不僅參與體內(nèi)多種生理、營養(yǎng)、代謝過程，也參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)［5-8］。在大腸桿菌細(xì)胞中，色氨酸的合成路徑由中心代謝途徑、莽草酸途徑和色氨酸分支途徑組成［72-74］。中心代謝途徑是指葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑（EMP）和戊糖磷酸途徑（HMP），形成的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）與赤蘚糖-4-磷酸（E4P），在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）合酶（AroG）的催化下縮合形成DAHP 的過程。莽草酸途徑是指DAHP 經(jīng)過3-脫氫奎寧酸合酶（AroB）、3-脫氫奎寧酸脫水酶（AroD）、莽草酸脫氫還原酶（AroE）、莽草酸激酶（AroK）、5-烯醇式丙酮酰胺莽草酸合酶（AroA）、分支酸合酶（AroC）催化形成分支酸的過程。色氨酸分支途徑是指分支酸經(jīng)鄰氨基苯甲酸合酶（TrpE）、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶（TrpD）、鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶（TrpC）、色氨酸合酶（TrpB）、吲哚甘油3-磷酸（TrpA）作用形成色氨酸的過程［73，75-76］（圖2）。

圖2 大腸桿菌色氨酸合成代謝路徑Fig.2 Schematic of the tryptophan biosynthetic pathway in E.coli

大腸桿菌細(xì)胞工廠合成色氨酸主要存在以下瓶頸：①色氨酸的生物合成途徑中關(guān)鍵酶AroG、TrpE 存在反饋阻遏，例如AroG 受苯丙氨酸和酪氨酸協(xié)同反饋抑制，色氨酸增強這種抑制，當(dāng)3種氨基酸共同存在時最大抑制作用接近90%；TrpE 不僅受色氨酸反饋抑制，而且還受色氨酸的反饋阻遏［62，73］。②色氨酸對色氨酸合成路徑關(guān)鍵酶（色氨酸操縱子trpEDCBA）與轉(zhuǎn)運蛋白（mtr）存在反饋阻遏［77-79］。③芳香族氨基酸合成支路與色氨酸合成途徑的競爭代謝流，減弱了色氨酸合成的代謝流［73］。④在大腸桿菌色氨酸的代謝調(diào)控中，采用降解色氨酸的方式調(diào)控胞內(nèi)色氨酸的濃度，色氨酸酶（TnaA）將色氨酸降解為吲哚、氨和丙酮酸［80］。

2.2 色氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

大腸桿菌細(xì)胞中存在天然的色氨酸生物合成途徑，通過強化本源代謝路徑，可以實現(xiàn)大腸桿菌色氨酸的合成。Aiba 等［59］在色氨酸操縱子阻遏蛋白（TrpR）和色氨酸酶（TnaA）雙缺菌株中，強化色氨酸操縱子基因的表達(dá)，并通過化學(xué)誘變，構(gòu)建了可以生產(chǎn)30 g/L 色氨酸的大腸桿菌細(xì)胞工廠；在此基礎(chǔ)上，研究人員通過加入表面活性劑，降低發(fā)酵液中色氨酸的溶解度，加速色氨酸結(jié)晶，使色氨酸產(chǎn)量增加到54.5 g/L。近年來，圍繞大腸桿菌細(xì)胞工廠生產(chǎn)色氨酸的研究工作主要集中在阻斷支路代謝和色氨酸分解代謝、解除色氨酸反饋調(diào)節(jié)與增加前體供應(yīng)。敲除或者弱化芳香族氨基酸合成支路關(guān)鍵酶PheA（預(yù)苯酸脫水酶）和TyrA（預(yù)苯酸脫氫酶），可以阻斷色氨酸合成途徑的競爭支路，增加色氨酸合成的代謝流［73］；敲除色氨酸酶（TnaA）可以減弱色氨酸的分解［80］，例如敲除tnaA的，使工程菌E.coliFB-02/pSV03的色氨酸產(chǎn)量增加了1.7倍，達(dá)到7.8 g/L。在此基礎(chǔ)上，敲除pheA和tyrA，使色氨酸的產(chǎn)量增加了0.7 倍達(dá)到13.3 g/L［60］。解除色氨酸反饋調(diào)節(jié)主要包括解除色氨酸對色氨酸合成路徑關(guān)鍵酶的反饋阻遏與解除中間代謝物對關(guān)鍵酶的反饋抑制。通過敲除trpR（編碼阻遏蛋白TrpR基因），解除了阻遏蛋白TrpR，對色氨酸合成路徑關(guān)鍵酶（色氨酸操縱子trpEDCBA）與轉(zhuǎn)運蛋白（mtr）的反饋阻遏［77-79］。例如，在工程菌E. coliAE1 （pSC101 trp·I15）中敲除trpR，獲得工程菌E. coliRam（pSC101 trp·I15），使色氨酸產(chǎn)量增加了5.4 倍［61］。篩選抗反饋調(diào)節(jié)的突變體，是解除中間代謝物對色氨酸合成關(guān)鍵酶反饋抑制的有效手段。例如將AroG（DAHP 合酶）第150 位的氨基酸殘基由脯氨酸突變?yōu)榱涟彼幔≒150L），或者把第146位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０罚―146N），可以完全解除苯丙氨酸對AroG的反饋抑制［81］；將TrpE（鄰氨基苯甲酸合酶）第40 位的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼幔⊿40F），可以完全解除色氨酸對TrpE 的反饋抑制［78］。在苯丙氨酸合成菌株中，將AroG 的第146 位氨基酸殘基由天冬氨酸突變?yōu)樘於０罚―146N），使苯丙氨酸的產(chǎn)量增加了51.4%［82］。色氨酸有兩個關(guān)鍵前體：PEP 和E4P，它們是色氨酸合成路徑中關(guān)鍵中間代謝物DAHP 的限制性底物，直接決定色氨酸合成能力［83］。目前增加胞內(nèi)PEP 含量的常用策略包括：①阻斷PEP 競爭支路代謝，例如敲除PykF 與PykA（丙酮酸激酶），與敲除Ppc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）［84］；②阻斷磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS），減少葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中PEP 的消耗［85-86］；③敲除碳儲存調(diào)控因子（CsrA），增強糖酵解途徑碳通量［87］；④增強PEP循環(huán)再利用，例如過表達(dá)PpsA（磷酸烯醇式丙酮酸合酶）［88］。目前增加胞內(nèi)E4P 含量的主要策略：①過表達(dá)TktA（轉(zhuǎn)酮酶）［89］；②敲除Pgi（磷酸葡萄糖異構(gòu)酶）［90］。例如，Zhang等［62］首先通過表達(dá)色氨酸操縱子（trpEDCBA）、抗反饋調(diào)節(jié)的DAHP合酶（AroGfbr）和敲除色氨酸阻遏蛋白（TrpR），構(gòu)建了合成色氨酸的底盤微生物，并通過敲除pykF和ptsH，增加胞內(nèi)PEP 含量，使色氨酸產(chǎn)量增加到11 g/L。為了恢復(fù)細(xì)胞生長，通過組合優(yōu)化葡萄糖激酶（GalP）和半乳糖滲透酶（Glk）的表達(dá)，使色氨酸的產(chǎn)量增加到37 g/L，在此基礎(chǔ)上，通過抑制乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)減弱乙酸的積累，使色氨酸的產(chǎn)量進一步增加到39.7 g/L，對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率增加到16.7%［62］。Chen 等［63］在前期構(gòu)建合成色氨酸底盤微生物E.coliTRTH 的基礎(chǔ)上，利用不同強度的啟動子和不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒組合優(yōu)化乙酰輔酶A 合酶，重構(gòu)了TCA 循環(huán)，增加了前體PEP 的供應(yīng)，減弱了乙酸的積累，獲得工程菌E.coliT16，使色氨酸的產(chǎn)量增加到54.6 g/L（表1）。

3 纈氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠

3.1 纈氨酸的生物合成途徑

纈氨酸不僅可以促進哺乳動物的乳汁分泌，而且還可以提高動物的免疫力，增加動物細(xì)胞外傷治愈的作用［5-8］。葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑合成纈氨酸重要前體丙酮酸，2 分子丙酮酸在乙酰羥酸合酶（IlvBN、IlvGM 和IlvIH）作用下縮合成2-乙酰羥酸。然后，在乙酰羥酸還原異構(gòu)酶（IlvC）的催化下，將2-乙酰羥酸催化生成雙羥基異戊酸。最后，雙羥基異戊酸經(jīng)過二羥酸脫水酶（IlvD）脫水形成2-酮異戊酸，2-酮異戊酸在轉(zhuǎn)氨酶B（IlvE）作用下形成纈氨酸［64］（圖3）。

圖3 大腸桿菌纈氨酸合成代謝路徑Fig.3 Schematic of valine biosynthetic pathway in E.coli

大腸桿菌細(xì)胞工廠合成纈氨酸主要存在以下問題：①乙酰羥酸合酶受纈氨酸反饋抑制，而且亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸對轉(zhuǎn)氨酶B存在協(xié)同反饋抑制［65］；②強化纈氨酸轉(zhuǎn)運，降低胞內(nèi)纈氨酸的積累，減緩纈氨酸積累造成的反饋抑制［64，91］；③由于乙酰羥酸還原異構(gòu)酶催化活性需要輔因子NADPH 提供還原力，因此纈氨酸合成需要提供充足的輔因子［66］；④纈氨酸關(guān)鍵前體丙酮酸也可合成丙氨酸、乙酰輔酶A、草酰乙酸等，這些代謝物的合成，競爭了纈氨酸的前體物質(zhì)［64］。

3.2 纈氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

通過改造大腸桿菌本源代謝路徑，可以實現(xiàn)纈氨酸的合成。例如，Park 等［64］通過定點突變獲得抗反饋調(diào)節(jié)的乙酰羥酸合酶Ⅲ，并在基因組上用tac 啟動子強化纈氨酸操縱子（ilvGMEDA）的表達(dá)，同時敲除蘇氨酸脫水酶（IlvA）、2-異丙基蘋果酸合酶（LeuA）和3-甲基-2-氧代丁酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（PanB），再強化乙酰羥酸合酶（IlvBN）表達(dá)，獲得工程菌E. coliVal 可以生產(chǎn)1.31 g/L 的纈氨酸。為了進一步提高纈氨酸的產(chǎn)量，開發(fā)了強化代謝合成路徑效率、輔因子工程和轉(zhuǎn)運子工程策略。強化代謝合成路徑效率包括強化前體供應(yīng)和解除路徑酶的反饋抑制。例如Park 等［64］利用網(wǎng)絡(luò)模型模擬基因敲除對纈氨酸生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)敲除丙酮酸脫氫酶（AceF）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（TpiA）、磷酸果糖激酶（PfkA/B）和蘋果酸脫氫酶（Mdh），可以增加纈氨酸前體丙酮酸的積累，并通過實驗驗證發(fā)現(xiàn)敲除AceF、PfkA 和Mdh，使纈氨酸產(chǎn)量增加1.27 倍。研究人員發(fā)現(xiàn)將乙酰羥酸合酶小亞基（IlvN）的第20～22 位氨基酸殘基分別由甘氨酸（G）、纈氨酸（V）、甲硫氨酸（M）替換為天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）和苯丙氨酸（F），解除了纈氨酸對乙酰羥酸合酶的反饋抑制，使纈氨酸的產(chǎn)量增加了22%［65］。輔因子工程策略包括修飾輔因子特異性與輔因子再生。例如，在纈氨酸生產(chǎn)過程中，使用枯草芽孢桿菌來源NADH 依賴性的亮氨酸脫氫酶（BsLeuDH），替換大腸桿菌本源NADPH 依賴性的氨基轉(zhuǎn)移酶（EcilvE）， 使 纈 氨 酸 產(chǎn) 量 增 加 了 2.2 倍［66］。Hao 等［67］通過借鑒改變谷氨酸棒桿菌乙酰羥酸還原異構(gòu)酶輔因子偏好性的方法，將大腸桿菌乙酰羥酸還原異構(gòu)酶（EcilvC）的第67 位氨基酸殘基由亮氨酸（L）替換為谷氨酸（E）、第68 位氨基酸殘基由精氨酸（R）替換為苯丙氨酸（F）、第75位氨基酸殘基由賴氨酸（K）替換為谷氨酸，使EcilvC 從NADPH 依賴性改變成為NADH 依賴性。在此基礎(chǔ)上，利用BsLeuDH 替換EcilvE，使纈氨酸產(chǎn)量增加了5.6 倍。為了強化纈氨酸合成過程中輔因子的供給，強化吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的表達(dá)，將NADH/NAD+的比例從11.0 增加到11.9，使纈氨酸產(chǎn)量增加了5.3%；而敲除乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶和乙醇脫氫酶減少輔因子的消耗，將NADH/NAD+的比例從11.0 增加到13.5，使纈氨酸的產(chǎn)量增加了23.5%［67］。研究表明，增強纈氨酸的轉(zhuǎn)運，是降低胞內(nèi)纈氨酸積累水平、緩解纈氨酸積累引起反饋抑制的有效策略［64］。例如，在E.coliVHY13 中，過表達(dá)谷氨酸棒桿菌來源的纈氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（BrnFE），使纈氨酸產(chǎn)量增加了72%［67］。在工程菌E.coliVal 中，過表達(dá)大腸桿菌本源的纈氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（YgaZH），使纈氨酸產(chǎn)量增加了47.1%［64］（表1）。

4 精氨基酸大腸桿菌細(xì)胞工廠

4.1 精氨酸的生物合成途徑

精氨酸在生命活動過程中有著十分重要的作用，參與哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的氨解毒、激素的分泌（包括生長激素、催乳素、胰島素、胰高血糖素等）以及免疫系統(tǒng)等多種生化反應(yīng)，主要是促進動物生長發(fā)育、提高幼仔的存活率、改善肉質(zhì)、提高飼料利用率等［5-8］。糖酵解途徑形成的丙酮酸，以乙酰輔酶A 的形式進入檸檬酸循環(huán)，檸檬酸循環(huán)中的α-酮戊二酸在谷氨酸合酶或者谷氨酸脫氫酶的催化下形成精氨酸的前體谷氨酸。如圖4所示，根據(jù)乙酰化的作用方式，可以將微生物精氨酸合成路徑分為線性途徑、經(jīng)濟循環(huán)途徑和新合成途徑3 種［92］。其中，大腸桿菌本源的精氨酸生物合成途徑是線性途徑［92］。在線性合成路徑中，谷氨酸在N-乙酰谷氨酸合酶（ArgA）的作用下合成乙酰谷氨酸，再經(jīng)過乙酰谷氨酸激酶（ArgB）、N-乙酰谷氨酸半醛脫氫酶（ArgC）、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ArgD）、乙酰鳥氨酸酶（ArgE）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ArgF）、精胺琥珀酸合酶（ArgG）和精氨琥珀酸酶（ArgH）作用下，形成精氨酸［69，93］［圖4（a）］。在經(jīng)濟循環(huán)途徑中由于不存在乙酰谷氨酸合酶，乙酰鳥氨酸在乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)移酶（ArgJ）的催化下形成鳥氨酸，同時將乙酰基轉(zhuǎn)移到谷氨酸上生成乙酰谷氨酸，即乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)移酶同時發(fā)揮乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶的作用，從而使乙?；鶊F在精氨酸合成途徑中循環(huán)利用［92］［圖 4（b）］。此外，在野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）中，發(fā)現(xiàn)一條合成精氨酸的新途徑，在該合成途徑中，乙酰鳥氨酸被乙酰鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶（ArgF′）催化生成乙酰瓜氨酸，然后乙酰瓜氨酸被催化脫乙酰生成瓜氨酸，再由瓜氨酸合成精氨酸［94］［圖4（c）］。

圖4 微生物體內(nèi)精氨酸合成代謝路徑Fig.4 Schematic of arginine biosynthetic pathway in microorganisms

大腸桿菌細(xì)胞工廠合成精氨酸主要存在以下瓶頸：①精氨酸合成路徑關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸合酶，以及其合成路徑酶（ArgB、ArgC、ArgD、ArgE、ArgF、ArgG 和ArgH）均受到精氨酸的反饋抑制［95］；②精氨酸與ArgR（精氨酸合成途徑阻遏蛋白）相互作用，反饋阻遏精氨酸合成路徑［96］；③谷氨酸不僅是合成精氨酸的前體物質(zhì)，同時也用于合成脯氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸，減弱了合成精氨酸的代謝流［92］；④由于大腸桿菌中存在精氨酸分解代謝途徑（例如精氨酸酶途徑、精氨酸脫亞氨基酶途徑、精氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶途徑等），胞內(nèi)合成的精氨酸如不及時轉(zhuǎn)運到胞外，會增加精氨酸分解代謝的風(fēng)險［92，97］。

4.2 精氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

Rajagopal等［98］在抗反饋調(diào)節(jié)N-乙酰谷氨酸合酶突變株E.coliEE11、E.coliEE17 和E.coliEE51 中 ，過表達(dá)氨基甲酸酯磷酸合酶和精氨酸酶，使精氨酸產(chǎn)率提高了 3～15 倍。Xu 等［68］在E.coliJM109 中，過量表達(dá)鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatumSYPA5-5）來源的 argCJBDFRGH 基因簇（argR 已失活），可以積累40 mg/L 的精氨酸。為了進一步強化精氨酸大腸桿菌細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能，發(fā)展了阻斷競爭代謝路徑、強化精氨酸轉(zhuǎn)運、解除精氨酸對關(guān)鍵酶的反饋抑制等策略。例如Ginesy等［69］以E.coliC600+為出發(fā)菌株，首先敲除SpeC（鳥氨酸脫羧酶）、SpeF（鳥氨酸脫羧酶）和AdiA（精氨酸脫羧酶），阻斷競爭代謝路徑；敲除ArgR（精氨酸合成途徑阻遏蛋白）和過表達(dá)抗反饋調(diào)節(jié)的ArgA215，解除精氨酸的反饋抑制，使精氨酸產(chǎn)量增加到3.03 g/L。在此基礎(chǔ)上，研究人員通過敲除本源ArgA 和增加ArgA215 的拷貝數(shù)，使精氨酸產(chǎn)量進一步增加到4.11 g/L。然后，通過表達(dá)ArgO（精氨酸轉(zhuǎn)運蛋白），強化精氨酸的轉(zhuǎn)運，獲得工程菌E.coliSJB009，使精氨酸產(chǎn)量增加到11.64 g/L。Ginesy 等［99］對發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，使工程菌E. coliSJB009 精氨酸得率增加到0.16 g/g。此外，Sander等［70］在E.coliMG1655中過表達(dá)精氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（ArgO）和抗反饋調(diào)節(jié)的ArgAH15A，同時敲除ArgR，獲得工程菌E. coliKO，可以生產(chǎn)1.03 g/L 的精氨酸。但是，研究人員發(fā)現(xiàn)敲除ArgR 會影響工程菌生長，降低發(fā)酵生產(chǎn)性能。利用代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)敲除ArgR 導(dǎo)致鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶活性增加17 倍，干擾了精氨酸-嘧啶的分支點，限制了嘧啶核苷酸的生物合成，導(dǎo)致ArgR 缺失菌株生長不良。利用CRISPRi 技術(shù)在基因組上下調(diào)ArgR，使工程菌的細(xì)胞生長速率增加2倍［70］（表1）。

5 展 望

在飼料中添加飼用氨基酸，可以適當(dāng)降低原料中的蛋白質(zhì)水平，降低飼料生產(chǎn)成本，降低氮排放，減少環(huán)境污染。然而，由于天然大腸桿菌細(xì)胞工廠合成飼用氨基酸的生產(chǎn)性能較低，不具備工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟可行性。因此，需要借助合成生物學(xué)與代謝工程技術(shù)，重新設(shè)計與優(yōu)化大腸桿菌細(xì)胞工廠，提高飼用氨基酸細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能。目前，研究人員利用合成生物學(xué)技術(shù)，改造大腸桿菌細(xì)胞工廠，實現(xiàn)了色氨酸、蘇氨酸和纈氨酸工業(yè)化生產(chǎn)，改造谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠實現(xiàn)了精氨酸、賴氨酸工業(yè)化生產(chǎn)。然而，由于甲硫氨酸代謝合成網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞工廠還難以實現(xiàn)甲硫氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

隨著市場對飼用氨基酸需求的不斷增加，氨基酸生產(chǎn)市場的同質(zhì)性競爭日趨激烈，提高工程菌株魯棒性，降低飼用氨基酸生產(chǎn)成本，與提升飼用氨基酸生產(chǎn)技術(shù)水平是未來的發(fā)展方向。提高大腸桿菌細(xì)胞工廠的魯棒性，不僅可以增強大腸桿菌細(xì)胞工廠對有害環(huán)境的耐受能力，而且還可以提升飼用氨基酸發(fā)酵性能，簡化發(fā)酵過程控制和產(chǎn)品分離提純工藝，降低生產(chǎn)成本，例如通過與合成生物學(xué)相結(jié)合的誘變育種策略，提高了工程菌對噬菌體的魯棒性。目前，主要以“糧食作物生物質(zhì)”為原料生產(chǎn)飼用氨基酸，存在“與人爭糧、與糧爭地”等問題。利用合成生物學(xué)與代謝工程技術(shù)，構(gòu)建了以甘油、木質(zhì)纖維素水解液和細(xì)菌細(xì)胞裂解液等非糧生物質(zhì)為原料的飼用氨基酸生產(chǎn)菌株，不僅可以降低飼用氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)成本，而且還可以實現(xiàn)“不與人爭糧、不與糧爭地”的目標(biāo)，例如，研究人員利用合成生物學(xué)技術(shù)與代謝工程技術(shù)，對大腸桿菌細(xì)胞工廠進行改造，實現(xiàn)了以木質(zhì)纖維素水解液為底物生產(chǎn)賴氨酸，以細(xì)菌細(xì)胞裂解液作為氮源生產(chǎn)色氨酸，以甘油為底物生產(chǎn)色氨酸。

然而，由于大腸桿菌細(xì)胞精密的調(diào)控機制、復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及外界脅迫環(huán)境，限制了飼用氨基酸大腸桿菌細(xì)胞工廠性能的進一步提升。此外，基于基因敲除和過表達(dá)的靜態(tài)調(diào)控策略，通過剪接代謝路徑，構(gòu)建的合成目標(biāo)化學(xué)品代謝通路，常常導(dǎo)致宿主菌代謝流擾動與失衡，增加細(xì)胞代謝負(fù)荷，降低了大腸桿菌細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能，限制了飼用氨基酸生產(chǎn)技術(shù)水平提升。因此，開發(fā)大腸桿菌全細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)模型，計算和設(shè)計飼用氨基酸的最優(yōu)合成路徑；發(fā)展新型生物傳感器，建立響應(yīng)外界環(huán)境與胞內(nèi)代謝物的基因回路，精確調(diào)節(jié)飼用氨基酸合成路徑的物質(zhì)流和能量流；研究外界脅迫環(huán)境對大腸桿菌細(xì)胞的影響，特異性增強大腸桿菌細(xì)胞對外界脅迫環(huán)境的耐受性，是未來的發(fā)展方向。