基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PODNL1基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床價(jià)值

丁 億，熊世達(dá)，鄧 文，何文瑞，郭 炬

(南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2019級(jí)；b.研究生院醫(yī)學(xué)部2018級(jí);c.第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006)

腎細(xì)胞癌是來(lái)源于腎小管上皮細(xì)胞的異質(zhì)性癌癥，占所有癌癥發(fā)病率的3%～5%[1]，其組織學(xué)亞型有腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinomas，KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌和腎嫌色細(xì)胞癌。KIRC為主要的組織學(xué)亞型，約占所有腎癌患者的70%～75%[2]。臨床上大多數(shù)KIRC患者對(duì)長(zhǎng)期使用化療或放療易產(chǎn)生耐受，故手術(shù)切除是其目前的主要治療方法。此外，約有1/3的KIRC早期確診患者伴有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故雖經(jīng)手術(shù)治療達(dá)到臨床治愈，仍約有1/4的患者在術(shù)后隨訪中發(fā)生遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)[3-5]。KIRC患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與其不良預(yù)后相關(guān)[2,6]，因此，尋找新的有效的分子標(biāo)記物，對(duì)改善患者的預(yù)后具有重要意義。

有研究[7]指出，Podocan樣1(PODNL1)蛋白具有信號(hào)肽，1個(gè)富含半胱氨酸的N端簇，21個(gè)富含氨基酸的重復(fù)基序和1個(gè)假定的N-糖基化位點(diǎn)，在蛋白結(jié)構(gòu)上類似于Podocan的蛋白，是富含亮氨酸的小重復(fù)蛋白聚糖(SLRPs)家族的成員之一。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，PODNL1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并且能夠影響其生物學(xué)功能。然而，關(guān)于PODNL1在KIRC中的表達(dá)、與臨床預(yù)后的相關(guān)性及分子機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析PODNL1在KIRC中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值，并利用基因集富集分析(GSEA)預(yù)測(cè)其可能的分子機(jī)制，旨在為KIRC篩選可靠的分子靶標(biāo)提供線索和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.tcga.org/)中下載KIRC的mRNA數(shù)據(jù)和相關(guān)共獲得KIRC患者組織樣本539例，正常組織樣本72例作為對(duì)照。使用R 4.0.4軟件提取PODNL1在KIRC組織和正常組織中的表達(dá)情況，通過(guò)WilCox檢驗(yàn)比較2組PODNL1的表達(dá)；采用WilCox檢驗(yàn)對(duì)72對(duì)KIRC組織和正常組織中的PODNL1的表達(dá)進(jìn)行配對(duì)差異分析。此外，從下載的臨床數(shù)據(jù)中分別提取患者的臨床資料，包括年齡、性別、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、腫瘤分級(jí)、臨床分期、TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 PODNL1的表達(dá)及其與KIRC患者預(yù)后關(guān)系的分析

根據(jù)PODNL1表達(dá)在KIRC組織中表達(dá)的中位值，將KIRC患者分為2組：高表達(dá)組和低表達(dá)組。利用R軟件，通過(guò)WilCoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)和邏輯回歸分析PODNL1基因表達(dá)與患者臨床參數(shù)的關(guān)系，包括腫瘤分級(jí)、臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；采用Kaplan-Meier生存分析2組的總體生存率(overall survival，OS)，采用單因素和多因素Cox回歸分析與患者預(yù)后相關(guān)的臨床因素，并分析PODNL1基因在KIRC預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PODNL1基因在各細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)水平

體外培養(yǎng)正常腎小管上皮細(xì)胞系HK2和KIRC細(xì)胞系A(chǔ)-498、786-O、ACHN、OSRC-2，細(xì)胞/組織中總RNA提取試劑(諾唯贊生物科技公司)提取細(xì)胞總RNA，HiFiScript cDNA Synthesis Kit(康為世紀(jì)生物科技公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)(賽維爾生物科技公司)進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-△△Ct方法對(duì)估計(jì)值進(jìn)行驗(yàn)證。PODNL1基因引物序列為上游引物：3′-CAACGGTGCTGTGACTCTG-5′；下游引物：3′-CCCTGCCCATGTACCCT-5′。ACTIN引物序列為上游引物：3′-TCTCCCAAGTCCACACAGG-5′；下游引物：3′-GGCACGAAGGCTCATCA-5′。

1.2.3 基因富集分析

基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)是一種在基因集的水平上研究微陣列數(shù)據(jù)的計(jì)算方法[9]。在本研究中，GSEA被用來(lái)確定PODNL1高表達(dá)組與低表達(dá)組之間的差異。以PODNL1表達(dá)作為表型標(biāo)記，利用GSEA 4.1.0軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析，并將隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)置為1000次。以標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(NES)的絕對(duì)值大于1，正常P<0.05和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于0.25的基因集為富集標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R 4.0.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用WilCox檢驗(yàn)分析PODNL1在KIRC組織和正常組織中的表達(dá)差異；WilCoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)和邏輯回歸分析PODNL1與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系；生存分析使用Kaplan-Meier方法；使用單因素Cox回歸分析總生存率(OS)與臨床相關(guān)因素之間的關(guān)系；采用多因素Cox分析，篩選獨(dú)立預(yù)后因素。用t檢驗(yàn)比較PODNL1基因在KIRC細(xì)胞系和正常細(xì)胞系中的表達(dá)差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PODNL1在KIRC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

與正常組織比較，PODNL1在KIRC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)。見(jiàn)圖1A。72對(duì)配對(duì)的KIRC組織和正常組織中PODNL1表達(dá)分析亦顯示，PODNL1基因在KIRC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(P=0.003)。見(jiàn)圖1B。RT-qPCR結(jié)果顯示，與HK2細(xì)胞比較，4種癌細(xì)胞系中PODNL1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A：PODNL1基因在腎臟正常組織和KIRC組織中的表達(dá)比較；B：72對(duì)配對(duì)的KIRC組織和癌旁組織中PODNL1的表達(dá)比較。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與HK2細(xì)胞比較。

2.2 PODNL1的表達(dá)與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

PODNL1在KIRC患者中的表達(dá)與腫瘤分級(jí)(P<0.001)、臨床分期(P<0.001)、腫瘤浸潤(rùn)深度(P<0.001)、淋巴結(jié)浸潤(rùn)(P=0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.001)均顯著相關(guān)。見(jiàn)圖3。邏輯回歸分析結(jié)果亦顯示PODNL1表達(dá)與臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)。見(jiàn)表1。

A：腫瘤分級(jí)(grade)；B：臨床分期(stage)；C：腫瘤浸潤(rùn)深度(T)；D：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)；E：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)。

表1 PODNL1表達(dá)與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PODNL1表達(dá)與患者OS、預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果(圖4A)顯示，KIRC組織中高表達(dá)組的總體生存率顯著低于低表達(dá)組(P<0.001)。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，PODNL1的表達(dá)、年齡、腫瘤分級(jí)(grade)、臨床分期(stage)、TNM分期與患者的生存相關(guān)(均P<0.05)；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、腫瘤分級(jí)(grade)和PODNL1表達(dá)均可作為KIRC預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。見(jiàn)表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸分析

圖4 PODNL1表達(dá)與KIRC患者OS的關(guān)系

2.4 GSEA富集分析

GSEA富集分析結(jié)果顯示，在PODNL1高表達(dá)組中，篩選出了9條與細(xì)胞黏附和腫瘤發(fā)生相關(guān)的重要信號(hào)通路顯著上調(diào)，包括細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、鈣信號(hào)通路、局部性粘連、Hh信號(hào)通路、P53信號(hào)通路，NOTCH信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路和腫瘤相關(guān)通路。見(jiàn)圖5。

圖5 GSEA富集分析KIRC中PODNL1高表達(dá)激活的信號(hào)通路

3 討論

富含亮氨酸重復(fù)序列的小分子蛋白聚糖家族(SLPRs)是蛋白聚糖的一個(gè)特殊亞群，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[10]。SLPRs廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，在各種癌癥中具有潛在的調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和遷移的作用[11-12]。而Podocan樣1(PODNL1)蛋白作為SLRPs的V類成員[13]，2011年首次被發(fā)現(xiàn)其存在于成骨細(xì)胞和新形成的骨骼中[7]。近年來(lái)，PODNL1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用被不少研究者關(guān)注。例如，TENG等[14]指出PODNL1可作為卵巢癌預(yù)后的生物標(biāo)記物。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中PODNL1的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/mTOR途徑促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移[8,15-16]。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)，PODNL1基因在KIRC組織中表達(dá)顯著上調(diào)；同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)PODNL1基因的mRNA表達(dá)水平在正常腎小管上皮細(xì)胞系顯著低于腎癌細(xì)胞系。此外，PODNL1的表達(dá)與KIRC患者的腫瘤分級(jí)、臨床分期和TNM分期相關(guān)，提示PODNL1參與KIRC的惡性進(jìn)展；PODNL1的表達(dá)與患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān)，單因素和多因素Cox回歸分析表明PODNL1是KIRC的獨(dú)立預(yù)后因子，提示PODNL1與患者的預(yù)后有關(guān)。而且，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)腫瘤相關(guān)通路在PODNL1高表達(dá)組織樣本中均有不同程度的富集。其中，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用已經(jīng)證明參與包括腎癌在內(nèi)的多種癌癥細(xì)胞的增殖和侵襲[17]；NOTCH信號(hào)通路異常激活后參與維持KIRC的干性功能特性[18]；抑制VEGF途徑是轉(zhuǎn)移性KIRC的分子靶向治療的關(guān)鍵點(diǎn)之一[19]。盡管PODNL1與這些腫瘤信號(hào)通路的關(guān)系尚未明確，但GSEA富集分析結(jié)果提示PODNL1高表達(dá)可能是促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和KIRC惡性進(jìn)展的重要因子。此外，雖然通過(guò)上述生物信息學(xué)分析顯示PODNL1基因是KIRC的獨(dú)立預(yù)后分子標(biāo)記物，但二者之間的確切關(guān)系及PODNL1與KIRC的作用與機(jī)制，仍需通過(guò)臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，PODNL1基因在KIRC組織中呈高表達(dá)，并與KIRC的惡性進(jìn)展相關(guān)，可能是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)記物。