上皮-間質轉化在胰腺纖維化中的作用及大柴胡湯的干預機制

馬 莉,段麗芳,許小凡,范建偉,張 紅,*

(1陜西中醫(yī)藥大學解剖學教研室,咸陽 712046;2陜西中醫(yī)藥大學病理生理學教研室;3陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學科研實驗中心;4陜西中醫(yī)藥大學解剖學實驗中心;*通訊作者,E-mail:zhangh1227@163.com)

在多種器官纖維化的研究中發(fā)現(xiàn),纖維化的進展與EMT相關[1-4]。在EMT過程中,極化良好的上皮細胞失去了頂端-基底極性和穩(wěn)定的細胞-細胞接觸,同時獲得了梭形的間充質樣細胞表型和產(chǎn)生細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的能力[5]。這些形態(tài)學變化與上皮標記物(如E-cadherin、claudins、occludins)的抑制和間葉細胞標記物(如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-cadherin)的增加有關[6,7]。

臨床和基礎研究均發(fā)現(xiàn),慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)病理特征主要是纖維化組織逐漸替代正常胰腺組織[8],纖維的發(fā)生與大量胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cell,PSC)活化產(chǎn)生ECM有關。近來研究發(fā)現(xiàn)體外激活的PSC可通過EMT途徑轉化為具有產(chǎn)生ECM能力的成纖維細胞[9]。在CP胰腺纖維化進展過程,胰腺組織是否發(fā)生EMT目前尚不清楚。臨床研究發(fā)現(xiàn)大柴胡湯可以減輕CP患者的臨床癥狀,課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)大柴胡湯對CP胰腺纖維化有抑制作用[10-14],然而大柴胡湯抗纖維化作用是否與胰腺的EMT有關尚不清楚。本研究擬復制小鼠CP模型觀察大柴胡湯對CP胰腺纖維化過程中EMT相關指標的影響,探究大柴胡湯防治CP胰腺纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康昆明(雌雄各半)小鼠,6-8周齡,體質量約16-21 g,購自空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心,許可證書號:0002365。

1.2 藥物及試劑

L-arginine(A6969-100G,Sigma公司,美國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(A045-3,南京建成生物研究所);大柴胡湯(陜西咸陽金秋診所中藥制劑室熬制);GAPDH(BM1623,武漢博士德生物工程有限公司);α-SMA(bs-10196R,北京博奧森生物科技有限公司);E-cadherin抗體(AE032517,武漢博士德生物工程有限公司);N-cadherin抗體(AF03317712,武漢博士德生物工程有限公司);濃縮型正常山羊血清(12CO2A09,武漢博士德生物工程有限公司);其他試劑由當?shù)厣镏苿┕咎峁┑姆治黾兓瘜W試劑。

1.3 儀器

Elx808酶標儀,美國伯騰儀器有限公司。Zeiss A1研究級正置數(shù)碼顯微鏡,蔡司光學儀器國際貿(mào)易有限公司。Western blotting電泳儀器(Bio-Rad電泳轉膜系統(tǒng)),美國BIO-RAD公司。化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Protein Simple FluorChem FC3),美國ProteinSimple公司。

1.4 實驗動物分組及造模

健康昆明(雌雄各半)小鼠78只,6-8周齡,體質量16-21 g,食量無差異、排便均正常。利用隨機數(shù)字表進行簡單隨機抽樣分為:空白組(n=18,每時間點6只)、CP組(n=30,每時間點10只)和大柴胡湯組(n=30,每時間點10只)。各組小鼠分籠飼養(yǎng),自由攝取標準飼料,自由飲水,室溫飼養(yǎng)。CP組和大柴胡湯組采用腹腔注射20%L-arginine,每周一次,每次兩遍,間隔1 h,每遍3 g/kg?？瞻捉M腹腔注射等體積的生理鹽水。大柴胡湯組在注射L-arginine 1周后,同時給予注射L-arginine和大柴胡湯灌胃治療5周(14 g/kg,每日一次)。本研究動物實驗總時長為6周,從給藥開始計時,各組于第2,4,6周麻醉分別處死小鼠,摘取小鼠胰腺組織,通過HE染色觀察胰腺組織的病理改變,免疫組化觀察胰腺組織中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA的表達變化,Western bloting檢測胰腺組織中E-cadherin、N-cadherin蛋白含量的改變。

1.5 標本的采集及處理

在對應時間點分別對各組進行取材。乙醚麻醉,固定于手術板上,75%酒精消毒,完整取出胰腺組織,置于生理鹽水中。利用隨機數(shù)字表進行簡單隨機抽樣分成2份,一份包埋于10%中性甲醛溶液浸泡中固定;另一份迅速放液氮中冷凍,隨后轉入-80 ℃冰箱保存。

1.6 胰腺組織病理學的觀察

已制備好的石蠟切片在65 ℃烘箱內(nèi)烤片1 h;二甲苯脫蠟、梯度脫水;蘇木素浸染2 min;流水洗1 min;1%鹽酸酒精分化15 s;流水沖洗1 h;1%伊紅浸染2 min;流水沖洗15 min;梯度酒精脫水、二甲苯透明;滴上中性樹膠,蓋玻片封固。

1.7 免疫組織化學染色觀察胰腺組織E-cadherin、N-cadherin及α-SMA的表達

10%甲醛固定胰腺組織,石蠟切片;切片常規(guī)脫蠟水化;枸櫞酸緩沖液抗原修復;滴加正常山羊血清封閉液,室溫靜置1 h;加Ⅰ抗(1 ∶200),4 ℃冰箱孵育兩夜;復溫1 h;TBST洗5次;加Ⅱ抗(1 ∶400),室溫孵育1 h;TBST洗5次;滴加試劑SABC,室溫40 min;TBST洗3次;DAB顯色3-4 min;TBST洗3次;蘇木素輕度復染,脫水、透明、封片。

1.8 Western blotting檢測胰腺組織E-cadherin、N-cadherin的蛋白水平

取出凍存胰腺組織,加入蛋白裂解液,勻漿;冰上孵育1 h,期間渦旋振蕩2次;4 ℃離心,10 000 r/min,10 min,分裝;提取離心上清液,BCA法蛋白定量,加入loading buffer將樣品稀釋至4 μg/μl,上樣至SDS-PAGE,電轉移至PVDF膜,封閉1 h;滴加GAPDH抗體(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶200)、N-cadherin(1 ∶200);4 ℃搖床脫色孵育過夜。室溫,TBST洗3次;滴加HRP標記的羊抗兔IgG抗體(1 ∶2 000),室溫搖床脫色孵育1.5 h;TBST洗3次;在Protein Simple化學發(fā)光成像系統(tǒng)下,選取適當曝光時間并拍照。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 慢性胰腺炎胰腺纖維化過程中EMT的變化

免疫組化結果顯示,空白組胰腺組織結構良好,胰腺小葉間無膠原纖維的沉積(見圖1)。CP組在第2周,胰腺組織中可見E-cadherin明顯表達,隨造模時間的延長,E-cadherin表達呈下降趨勢;CP組胰腺組織N-cadherin明顯表達,并隨造模時間的延長,N-cadherin的陽染表達呈上升趨勢(見圖1)。

圖1 E-cadherin與N-cadherin在CP模型的表達 (免疫組化,×400)Figure 1 E-cadherin and N-cadherin expression in CP model (immunohistochemical method,×400)

2.2 大柴胡湯對慢性胰腺炎胰腺纖維化的治療作用及對EMT的調(diào)節(jié)

2.2.1 大柴胡湯對慢性胰腺炎模型胰腺病理損傷的影響 HE染色可見,與空白組相比,CP組在第2周,小鼠胰腺組織出現(xiàn)水腫,少量炎細胞浸潤,腺泡萎縮及壞死,并可見少量膠原纖維沉積;第4周胰腺損傷持續(xù)加重,炎細胞浸潤增多,并出現(xiàn)管狀化結構,膠原纖維沉積加重;第6周胰腺小葉結構破壞嚴重,腺泡進一步萎縮,被大量的管狀化結構所取代,出現(xiàn)空泡樣結構,大量膠原纖維沉積(見圖2)。與CP組相比,大柴胡湯組第4周腺泡萎縮,炎細胞及膠原纖維沉積均減少;第6周胰腺組織僅有部分胰腺腺泡細胞出現(xiàn)損傷,胰腺組織中炎細胞浸潤、管狀化結構及膠原纖維沉積明顯減少(見圖2)。

圖2 大柴胡湯對胰腺病理損傷的影響 (HE,×100)Figure 2 Effect of Dachaihu decoction on pancreatic pathological injury in CP (HE staining,×100)

2.2.2 大柴胡湯對慢性胰腺炎模型胰腺纖維化中α-SMA表達的影響 CP組第2周即可見胰腺組織中α-SMA陽染表達增多,隨著纖維化程度的加重,CP組第4,6周小鼠胰腺組織中α-SMA的表達進一步增多,而大柴胡湯組各個時間點胰腺組織中α-SMA的表達均明顯減少(見圖3)。

圖3 大柴胡湯對胰腺纖維化中α-SMA表達的影響 (免疫組化,×200)Figure 3 Effect of Dacaihu decoction on α-SMA expression in pancreatic fibrosis in CP (immunohistochemical method,×200)

2.2.3 大柴胡湯對慢性胰腺炎模型胰腺纖維化進展中EMT相關調(diào)控蛋白表達影響 Western blotting檢測結果顯示:與空白組相比,CP組胰腺組織N-cadherin在造模第2,4周沒有明顯變化,但在第6周明顯高于空白組(P<0.01);而E-cadherin在空白組呈現(xiàn)一定的表達,造模第2周沒有明顯變化,但在第4,6周明顯降低(P<0.01)。與CP組相比,大柴胡湯組N-cadherin表達在第6周顯著下降(P<0.01),而E-cadherin表達在第6周顯著升高(P<0.01,見圖4)。提示慢性胰腺炎進展中伴隨EMT發(fā)生;而大柴胡湯治療后可明顯降低N-cadherin表達,升高N-cadherin表達,提示大柴胡湯可通過抑制EMT進程,改善胰腺纖維化,對慢性胰腺炎有治療效果。

與對照組比較,**P<0.01;與CP組比較,##P<0.01圖4 大柴胡湯對胰腺纖維化進展中E-cadherin、N-cadherin蛋白的影響Figure 4 Effects of the Dacaihu decoction on expression of E-cadherin and N-cadherin proteins in the progression of pancreatic fibrosis

3 討論

CP病因復雜,與胰腺癌的發(fā)生關系密切[15],確診后20-25年的死亡率為50%[16],CP的主要病理改變?yōu)橐认倮w維化,研究胰腺纖維化的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。

關于CP的發(fā)病機制,近年來的多項研究表明,胰腺纖維化的本質是以膠原為主的ECM合成增多,降解減少,導致過多的ECM(如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原)沉積[17,18]。新近的研究發(fā)現(xiàn),器官纖維化中異常聚集的成纖維細胞至少有1/3是經(jīng)EMT而來的[3,4]。EMT是Greenberg和Hay在1982年首次提出的[19],指上皮細胞發(fā)生轉化、失去極性,轉化為間質細胞的過程。之后的大量研究發(fā)現(xiàn),EMT存在3種類型:即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,它們屬于3種不同的生理病理過程。Ⅰ型主要發(fā)生在胚胎時期,參與胚胎的正常發(fā)育。Ⅲ型主要見于癌組織,與腫瘤細胞的浸潤與轉移有關。Ⅱ型主要見于組織纖維化進程中,參與損傷修復、組織再生和器官纖維化。EMT進展過程伴隨多個細胞分子標志物的變化。即上皮組織標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、β-連環(huán)素(β-catenin)等表達減少;而間葉組織標記物如波形蛋白(Vimentin)、N-鈣黏素(N-cadherin)、纖連蛋白(Fibronectin)表達上調(diào),其中E-cadherin表達下調(diào)是EMT發(fā)生中最重要的分子事件[20]。

研究發(fā)現(xiàn),活化的胰腺星狀細胞在胰腺的促纖維增生反應中發(fā)揮核心作用。PSC通常位于腺泡周圍,處于“靜止”狀態(tài),PSC受到刺激后會從正常的“靜止”狀態(tài)轉變?yōu)椤凹せ睢睜顟B(tài)(也稱為“肌成纖維細胞”狀態(tài))?；罨腜SC增殖、遷移并產(chǎn)生大量的ECM、細胞因子、趨化因子和生長因子[9,21,22]。本研究發(fā)現(xiàn),CP組隨著造模時間的延長,E-cadherin的陽染表達呈下降趨勢,在第4,6周明顯降低(P<0.01),而N-cadherin的陽染表達呈上升趨勢,在第6周明顯高于空白組(P<0.01),提示在CP病程進展中發(fā)生EMT樣轉化過程。隨造模時間的延長,PSC活化的重要標記物α-SMA表達明顯增高,提示PSC活化與胰腺纖維化進展中EMT過程相關。

中醫(yī)將慢性胰腺炎歸結為“腹痛、胃心痛、脅痛、泄瀉、瘕”等病癥范疇,多由外邪入侵、情志不舒、暴飲暴食、恣食肥甘或創(chuàng)傷等導致肝膽不利,內(nèi)生濕熱,堆滯中焦,中焦氣機不舒,隨后氣滯血瘀生濕蘊熱,邪熱壅塞。因此,對慢性胰腺炎的治療,一般在疏肝理氣,活血化瘀的基礎上使用清熱化濕,通里泄熱的藥物。大柴胡湯臨床治療胰腺炎療效確切[23,24],課題組前期實驗證明,大柴胡湯可抑制TGF-β/Smad信號通路的活化,調(diào)節(jié)MMP-1/TIMP-1的平衡,有效遏制CP病程進展中ECM合成[11-13],進而減輕胰腺纖維化。本研究發(fā)現(xiàn),與CP組相比,大柴胡湯組第6周,α-SMA表達明顯減少,N-cadherin表達顯著下降(P<0.01),而E-cadherin表達顯著升高(P<0.01)。提示大柴胡湯可以降低PSC的活化,減緩EMT進程,改善胰腺纖維化,對慢性胰腺炎有治療效果。

綜上所述,EMT參與CP小鼠胰腺纖維化進展,大柴胡湯不僅可以抑制α-SMA表達,降低PSC活化,而且可以減緩EMT進展,進而減少胰腺炎癥環(huán)境中ECM生成,改善CP小鼠纖維化。

致謝:本實驗在陜西省國際合作基地-免疫炎癥相關疾病中醫(yī)藥防治國際聯(lián)合研究中心各位成員的鼎力相助下圓滿完成。在此表達最誠摯的謝意!