人源大麻素受體的結構生物學研究

沈靈，華甜?，劉志杰??

①上海科技大學 iHuman研究所，上海 201210；② 上海科技大學 生命科學與技術學院，上海 201210

1 大麻及大麻素

大麻隸屬于植物界的被子植物門雙子葉植物綱蕁麻目?？拼舐閷佟Ｔ跊]有被人類廣泛使用前，大麻主要分布于印度、不丹和中亞細亞，目前在很多國家和地區(qū)均可以合法種植。大麻在醫(yī)藥、宗教、靈學和娛樂等領域均有較長的使用歷史，是一種在人類早期就開始種植的物種。據史料記載，大麻這一古老的藥用植物從公元200年前就一直作為治療多種疾病的植物藥使用[1]。

大麻/大麻素（marijuana/cannabinoid）在20世紀中后期就已經成為主流科學的研究目標，國際上很多科研機構均開始了對大麻素作用機制和藥用價值的研究。大麻中含有上百種活性化合物，這些化合物被統稱為植物性大麻素。其中的主要成分包括具有精神活性的四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol, THC）[2]和非精神活性的大麻二酚（cannabidiol, CBD）等。由于THC可以使人成癮，聯合國公約和許多國家的法律均把大麻列為“麻醉品”或“毒品”，對大麻的態(tài)度基本是采取限制、管制和監(jiān)察的措施。研究顯示，人類攝入THC含量小于0.3%不顯示精神活性，可以作為工業(yè)大麻添加使用，但是攝入THC含量大于0.3%則具有一定的藥用和濫用傾向[3-4]。因此，出于安全因素考慮，近年來各國普遍采用歐盟（農業(yè)）委員會制定的統一標準，即控制工業(yè)大麻原料干品的THC含量小于0.3%。目前大麻在現代醫(yī)學中的重要作用已經得到更加廣泛的研究和認可，THC和CBD在國外已被廣泛應用于醫(yī)藥研究中。例如，2018年分別被歐盟EMA和美國FDA批準上市治療兒童癲癇病的新藥“Epidiolex”中的主要有效成分就是大麻中的CBD。

與大麻素相關的化合物是一類結構和功能多樣的化學物質，具體可分為以下三個大類（表1）。①植物性大麻素：從植物大麻中提取，具有可令人產生亢奮、幻覺及愉悅感的THC等。我國早期的藥書《本草綱目》和《神農本草經》[5]中就有關于植物性大麻素的醫(yī)藥和保健用途的大量記載，包括用其治療便秘、瘧疾和疼痛等。 在20世紀40年代，Todd和Adams分離出了一種具有弱神經作用的成分CBD[6-7]，從此對大麻的研究才真正開始。但是直到1964年，科學家才首次分離和合成出大麻的主要活性成分THC，為之后化學家設計結構類似物及新型合成類大麻素提供了分子基礎。②內源性大麻素：由生物體內自身合成產生，主要是一些酰胺、脂類，或細胞膜表面的脂質前體被某些酶催化加工后的脂類化合物[8]。它們均具有與植物性大麻素THC相似的三維結構。③合成型大麻素：由實驗室或者工業(yè)合成，具有植物性大麻素和內源性大麻素的部分或全部生理特性，是天然大麻素的輔品或者替代品。一些合成型大麻素對大麻素受體的激活或拮抗能力比天然大麻素強4～5倍，甚至可以高百倍以上。因此這些合成型大麻素和天然大麻素相比會對人體的一些生理系統與器官，如神經系統、消化系統（腸胃）、心血管系統等有毒副作用[9]。但是，天然及合成大麻素如果嚴格按照藥物評價的標準流程進行研發(fā)，那么它們在治療疼痛、抑郁癥、癲癇癥、焦慮、癌癥、免疫類相關疾病，以及肥胖癥等方面具有較好的應用前景。

表1 經典大麻素的有效成分以及功能簡介

2 內源性大麻素系統

內源性大麻素系統（endocannabinoid system,ECS/eCBs）在人體內廣泛分布，主要由內源性大麻素N-花生四烯酸乙醇胺（anandamine,AEA）和2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol, 2-AG），以及與它們相互作用的受體和負責合成代謝及降解內源性大麻素的酶（fatty acid amide hydrolase, FAAH; monoacylglycerol lipase, MAGL）所組成[10]。ECS在整個大腦中的表達方式多種多樣，它們涉及神經傳遞、記憶形成和炎癥反應的調節(jié)和微調，同時在神經發(fā)育中起關鍵作用。在神經通路、神經元或者其他類型的細胞中，這些小分子、酶或者一至兩種大麻素受體共同作用形成的ECS，可以發(fā)揮不同的生理功能[11]，其中包括學習、記憶、炎癥、食欲、消化、能量平衡、代謝、睡眠周期、壓力、情緒和成癮等[12]，因此ECS中的很多重要組分均是潛在的藥物靶點。

3 大麻素受體CB1和CB2及其信號轉導通路

目前已知的大麻素受體（cannabinoid receptor）屬于G蛋白偶聯受體（G protein coupled receptor, GPCR）中的Class A家族，主要包括大麻素受體亞型I（cannabinoid receptor type 1, CB1）和大麻素受體亞型II（cannabinoid receptor type 2, CB2）。CB1和CB2具有44%的序列同源性[13]，其中CB1主要分布在腦區(qū)的大腦皮層、海馬、小腦和基底核等[14]，同時在脊髓和外周神經系統中也有少量分布，所以CB1又被稱為中樞型大麻素受體。它的激活可以降低神經遞質的釋放，例如多巴胺，進而參與調節(jié)認知、記憶和運動控制等。CB2則主要在外周免疫系統高表達，例如扁桃體、胸腺免疫細胞和脾臟邊緣區(qū)等，所以CB2又被稱為外周型大麻素受體，在調節(jié)免疫系統內外因子的釋放和免疫性細胞的遷徙中發(fā)揮重要作用[15]。CB1和CB2均可調節(jié)化學遞質的釋放，不過CB1的主要來源是神經細胞，CB2則來源于免疫細胞。

大麻素受體CB1和CB2主要通過與G蛋白Gi/o亞型偶聯進行下游信號轉導。當受體結合激動劑后，會抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，導致細胞內的環(huán)化腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）降低[16]。CB1在某些特定條件下，激動劑與受體結合后，也會與G蛋白Gs[17]或者Gq[18]亞型偶聯并介導下游信號傳遞。近年來的研究表明，大麻素受體CB1和CB2也可以通過阻遏蛋白（arrestin）介導下游信號轉導，廣泛地參與多種細胞生理活動，調節(jié)與G蛋白不同的生理功能。大麻素受體介導的信號通路與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關，因此是非常重要的藥物靶點[19]。

4 大麻素受體CB1的結構研究進展

人源大麻素受體CB1于1990年被成功克隆，由472個氨基酸組成，屬于GPCR Class A家族的α分支。2016年，第一個CB1與拮抗劑AM6538復合物的2.8 ?（1 ? = 10-10m）晶體結構被成功解析[20], 隨后CB1與拮抗劑Taranabant的三維結構也得到解析[21]。CB1與AM6538及CB1與Taranabant復合物的三維精細結構揭示了受體的重要結構特征以及與拮抗劑結合的關鍵相互作用（圖1（a、b））。整體結構顯示，CB1具有GPCR典型的七次跨膜結構，由胞內3個loop（ICLs）和胞外3個loop（ECLs）以及第8個螺旋（Helix 8）組成。CB1的N端構象比較特殊，在拮抗劑配體的識別中起到了關鍵作用。具體而言，CB1的N端（99～112）氨基酸殘基形成V型環(huán)并從垂直于細胞膜方向插入CB1的結合口袋，像一個塞子將結合口袋封閉。在已解析的與CB1同源性較高的脂類受體S1P1[22-23]（sphingosine-1-phosphate receptor 1）和LPA1（lysophosphatidic acid receptor 1）[24]中，它們的N端也形成有序的螺旋構象并從上方將結合口袋封閉，從而形成疏水的配體結合口袋，有利于配體的結合。之前的研究論文表明CB1的胞外第二個環(huán)（ ECL2）在蛋白表達、功能以及配體結合方面都非常重要[25]。CB1的晶體結構中顯示由21個氨基酸組成的ECL2折疊形成復雜結構，其中有4個氨基酸（268～271）插入結合口袋中。據報道，這4個氨基端對于介導某些特定配體的相互作用至關重要，而ECL2中的兩個半胱氨酸（Cys257、Cys264）形成的二硫鍵約束了整個ECL2的構象。

2017年Nature雜志發(fā)表了CB1分別與兩種新型激動劑小分子AM11542和AM841復合物的三維精細結構[26]（圖1（c、d））。該結構不僅揭示了激動劑小分子與CB1的相互作用模式，更重要的是，與之前解析的CB1-AM6538復合物的結構相比，CB1在激動劑小分子的調控下發(fā)生了很大的構象變化。CB1的N端以及七次跨膜螺旋的構象變化幅度在以往解析的GPCR結構中是最大的。同時，結合口袋體積發(fā)生了約53%的變化（激動劑的結合口袋體積為383 ?3，拮抗劑的結合口袋體積為821 ?3）。這些結構特征也從分子水平解釋了為什么CB1可以與多種不同類型的配體相互作用，參與和調控人體中很多非常重要的生理活動。CB1與激動劑復合物結構揭示的另一重要發(fā)現是，首次從三維結構上觀測到兩個氨基酸（Phe2003.36/Trp3566.48）在CB1激活過程中的協同構象變化，共同啟動CB1的激活過程，被稱之為“雙耦合開關”（twin toggle switch）。在此之前，人們觀測到的GPCR激活大多只需要一個氨基酸Trp6.48參與。CB1的“雙耦合開關”可能與其特殊的激活機制密切相關。

近年來隨著冷凍電鏡技術的突破，GPCR和下游信號轉導蛋白復合物的結構也得到了解析。2019年Krishna等人[27]解析了基于吲哚合成的大麻素MDMB-Fubinaca（FUB）結合的CB1-Gi的復合物結構，揭示了吲哚類激動劑對CB1的激活機制以及與G蛋白的相互作用模式（圖1（e））。但是基于THC衍生物的激動劑是如何激活CB1受體以及與G蛋白的偶聯機制仍然不是很清楚。2020年在Cell雜志上發(fā)表的CB1-AM841-Gi的結構有進一步描述和解釋[28]。如圖1（f）所示，CB1-AM841-Gi的總體結構類似于我們之前解析的與AM841結合的CB1晶體結構[26]，主要差異發(fā)生在CB1和G蛋白界面上，其中相互作用殘基由Gi穩(wěn)定，同時TM5的延長和TM5、TM6、ICL1和ICL2在細胞區(qū)域里的向內運動導致與Gαi蛋白結合的α5發(fā)生更多的極性和疏水相互作用[28]，而且在晶體結構中我們提到的雙耦合開關依舊在復合物結構中呈現打開的狀態(tài)，可見它們在CB1的激活過程中非常重要。

已經獲得的多種CB1結構（非活性狀態(tài)、激動劑結合的類活化狀態(tài)和活化狀態(tài)）揭示了重要的構象多樣性，并為我們提供了解密大麻素受體激活和信號轉導機制的結構基礎，可以看出CB1在不同狀態(tài)之間的過渡過程中具有可塑性，揭示了CB1能夠結合不同類型配體的分子理論依據。

5 大麻素受體CB2的結構研究進展

圖2 大麻素受體CB2與不同配體復合物的三維結構：（a）CB2-AM10257晶體結構（粉色螺旋表示CB2，粉色球棍狀表示AM10257）；（b）CB2-AM12033晶體結構（藍綠色螺旋表示CB2，藍綠色球棍狀表示AM12033）；（c）CB2-AM12033-Gi復合物電鏡結構（綠色螺旋表示CB2，綠色球棍狀表示AM12033，黃色表示Gαi亞基，青色表示Gβ亞基，粉色表示Gγ亞基）；（d）CB2-WIN-55,212-2-Gi復合物電鏡結構（紫色螺旋表示CB2，紫色球棍狀表示WIN-55,212-2，橙色表示Gαi亞基，青色表示Gβ亞基，粉色表示Gγ亞基）

Munro等人[15]于1993年首次從HL60細胞中克隆出大麻素受體CB2基因。CB2主要在免疫系統中表達，近幾年人們逐漸認識到CB2在免疫調節(jié)、炎癥、神經性疼痛、神經炎和神經退行性疾病治療中的潛在作用。人源大麻素受體CB2與拮抗劑復合物的結構于2019年首次獲得解析[29]（圖2（a）），2.8 ?分辨率的晶體結構清晰地揭示了CB2與拮抗劑AM10257的相互作用模式。研究者通過與CB1三維結構的對比分析，發(fā)現同處于拮抗狀態(tài)下的CB2與CB1結構差別很大。兩個受體靠近胞內的跨膜區(qū)結構均為收緊的狀態(tài)，但是靠近胞外的跨膜區(qū)包括N端的構象發(fā)生了很大變化。CB2 N端的10個氨基酸殘基在配體分子結合口袋的上方形成一段較短的螺旋，不像CB1的N端是形成V型loop插入結合口袋并參與小分子配體的相互作用。CB2接近胞外的跨膜區(qū)相比于CB1更加收緊，CB2的TM1、TM2、ECL2和ECL3都向其結構中心收攏。與CB1類似，ECL2內部也形成一對二硫鍵（Cys174、Cys179）[29]穩(wěn)定ECL2的構象。意外的是，拮抗劑結合的CB2反而與激動劑結合的CB1結構具有更高的相似性。

CB2的激動劑已經被證明可以有效地緩解炎癥導致的疼痛、神經性疼痛和眼科疾病等[30-31]。然而，大部分的大麻素受體激動劑選擇性差，會同時作用于兩個受體，引起因作用于CB1而產生的精神副作用。2020年初Cell上報道了CB2與激動劑AM12033的晶體結構[28]（圖2（b））。該結構與拮抗劑結合的CB2結構非常相似，激動劑AM12033和拮抗劑AM10257在CB2中的結合口袋也高度相似，僅僅是TM1、TM4和TM7的胞外部分向內微小運動形成了一個更緊湊的激動劑結合口袋。與激動劑結合的CB2和CB1在胞外跨膜區(qū)部分的結構也較為相似，而胞內部分CB1表現出了部分激活特征，CB2則仍處于非激活狀態(tài)。正是因為CB1和CB2在結構上的細微差異，造成了兩個大麻素受體在功能上的區(qū)別[28]。結構顯示，CB1和CB2的激動劑結合口袋非常相似，包括結合方式和關鍵氨基酸，這也從結構上解釋了大麻素受體激動劑選擇性差的原因。

CB2和CB1一樣主要通過與Gi/o蛋白偶聯來抑制腺苷酸環(huán)化酶和cAMP信號傳導而引起生理反應。與CB1-Gi復合物相比，CB2-AM12033-Gi復合物的結構顯示出相似的相互作用方式，CB2和Gi之間的接觸是通過Gαi亞基廣泛介導的，主要相互作用界面由受體的TM3、TM5、TM6和ICL2以及Gαi亞基的α5螺旋、αN螺旋和αN-β1環(huán)組成[28]（圖2（c））。與其他已解析的GPCR與Gi復合物的結構比較，CB2和CB1的TM5更加延伸，與Gαi亞基的α5螺旋形成更多的相互作用。通過CB1-AM841-Gi和CB2-AM12033-Gi復合物結構比較，發(fā)現ICL2可能是影響兩個受體對不同G蛋白的選擇性的因素之一。同期Cell報道了激動劑WIN55,212-2結合的CB2-Gi的復合物結構[32]（圖2（d）），由于與大多數CB1和CB2激動劑不同，WIN 55,212-2在不引起CB2內化的情況下激活G蛋白信號傳導途徑，該性質被認為避免了藥物耐受性的發(fā)展。這些結果提供了有意義的信息，從分子水平揭示了CB2與配體的相互作用以及信號轉導機制，將有助于合理設計和開發(fā)具有高親和力和選擇性的靶向CB2的小分子藥物。

6 結論與展望

由于在疼痛、肥胖、炎癥、癌癥和各種精神類疾病中的治療潛力，內源性大麻素系統一直以來就是一個極具吸引力的研究領域。然而大麻素受體CB1的正構激動劑發(fā)展成安全有效的藥物需要突破成癮或抑郁等副作用的壁壘，而CB2的配體尤其是正構激動劑則需要增強其特異性以避免觸發(fā)CB1或者其他潛在大麻素受體的活性。雖然近幾年關于CB1和CB2的結構生物學研究取得了一系列突破性進展，加深了人們對配體作用方式和機制的理解，但是進一步研究探索既沒有副作用又可以有效阻斷大麻素引起的過度反應，繼而提高大麻素類藥物治療指數的配體仍然至關重要。本文概述了有關大麻素以及內源性大麻素系統的一些特性，總結了大麻素受體的結構研究進展。這些發(fā)現讓我們對內源性大麻素系統有了基本的理解，希望將來可以從原子、分子、細胞甚至動物水平進一步研究不同配體對大麻素受體的調控機制，為設計優(yōu)化更加高效和安全的藥物提供指導。