趨化因子受體的結(jié)構(gòu)與信號轉(zhuǎn)導機制

劉凱雯，劉志杰，華甜

上?？萍即髮W iHuman研究所，上海 201210

趨化因子受體（chemokine receptor）是七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor, GPCR）超家族中的重要成員，通常表達于中性粒細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞等細胞膜上。GPCR是最大的膜蛋白家族，天然配體包括多肽、脂類、生物胺、糖蛋白、核苷酸和離子等，由其介導的信號通路在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，市場中約有40%的藥物是靶向GPCR的[1-2]。GPCR與配體或GPCR與配體及下游信號轉(zhuǎn)導分子復合物的三維結(jié)構(gòu)解析，以及基于結(jié)構(gòu)設計的細胞功能實驗，對于我們揭示GPCR與配體及GPCR下游信號轉(zhuǎn)導的分子機制十分重要。近十年來，GPCR結(jié)構(gòu)生物學技術飛速發(fā)展，人們對于趨化因子受體家族的結(jié)構(gòu)與功能研究也投入了大量精力進行探索并獲得了豐厚的知識。這些結(jié)構(gòu)對于趨化因子受體的激活和信號轉(zhuǎn)導機制研究，以及相關疾病的藥物設計研發(fā)提供了非常重要的理論基礎。

1 趨化因子及趨化因子受體

趨化因子（chemokine）是一種分子量為8～10 kDa的多肽，是最大的細胞因子家族，主要功能是招募血液中的單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等進入特定的淋巴器官和組織以及感染發(fā)生的部位。大多數(shù)趨化因子的氨基酸序列中有4個保守的半胱氨酸（Cys），并形成1或2對保守二硫鍵穩(wěn)定趨化因子的核心結(jié)構(gòu)[3-4]。根據(jù)保守的半胱氨酸殘基的間隔氨基酸個數(shù)，通常將它們分為4個亞類：CXC類、CC類、CX3C類和C類。其中CXC 類趨化因子可以根據(jù)結(jié)構(gòu)功能區(qū)第一個半胱氨酸靠近蛋白的氮（N）端處有無谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（Glu-Leu-Arg,ELR_）氨基酸特征性序列分為兩類：ELR+和ELR兩個亞家族[5]。趨化因子具有保守的二級結(jié)構(gòu)，一般由N端loop、3個反相平行的β折疊和1個碳（C）端α螺旋組成。

當成纖維細胞、表皮細胞、內(nèi)皮細胞等組織細胞及免疫細胞在受到刺激物，如生長因子、干擾素、病毒產(chǎn)物及細菌產(chǎn)物等的誘導時，可分泌出不同的趨化因子。相應的趨化因子受體受到調(diào)控后，會誘導中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、成纖維細胞等向炎癥部位聚集活化，并參與組織損傷修復。研究表明，在急性炎癥反應過程中，趨化因子在氨基葡聚糖作用下聚集至內(nèi)皮細胞表面，通過與表達相應趨化因子受體的白細胞相結(jié)合，促進內(nèi)皮細胞釋放大量促炎細胞因子，對炎癥反應起到關鍵作用[6-7]。

趨化因子受體是GPCR家族的重要成員，主要介導趨化因子的信號傳導，通常由300多個氨基酸組成。趨化因子受體根據(jù)其對應結(jié)合的趨化因子配體的分類也可分為4個亞類：XCR、CCR、CXCR、CX3CR。它們都具有類似的拓撲結(jié)構(gòu)，即7個跨膜螺旋區(qū)，細胞外的N端、3個細胞外loop、3個細胞內(nèi)loop和細胞內(nèi)C端。趨化因子受體被趨化因子等配體激活后，主要通過結(jié)合胞內(nèi)的G蛋白或阻遏蛋白（β-arrestin）等信號分子來進行下游信號轉(zhuǎn)導[8]。趨化因子及其受體在病原體的清除、炎癥反應、病原體感染、細胞及器官的發(fā)育、創(chuàng)傷的修復、腫瘤的形成及其轉(zhuǎn)移等方面都起著重要的作用。

2 趨化因子受體的結(jié)構(gòu)研究

GPCR的結(jié)構(gòu)生物學研究一直充滿挑戰(zhàn)，它們在異源系統(tǒng)中表達產(chǎn)量很低，也很難從中提取純化目的蛋白并保持其穩(wěn)定性。此外，GPCR一直處于動態(tài)平衡的構(gòu)象狀態(tài)，很難捕捉解析某一構(gòu)象狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。近年來，X-射線晶體學（X-ray crystallography）和冷凍電子顯微鏡（cryo-electron microscopy, Cryo-EM）技術等的發(fā)展，極大加速了GPCR的結(jié)構(gòu)解析。迄今為止，研究者已經(jīng)發(fā)表了27個趨化因子受體的結(jié)構(gòu)，包括13種獨特的結(jié)構(gòu)（圖1）。其中有5種趨化因子-趨化因子受體復合物晶體或電鏡三維結(jié)構(gòu)，包括首次解析的結(jié)合拮抗劑以及修飾過的病毒趨化因子的CXCR4[9]、結(jié)合CX3CL1的病毒趨化因子受體US28[10]、與拮抗劑5P7-CCL5結(jié)合的CCR5[11]、結(jié)合內(nèi)源性配體CCL20的CCR6-Go復合物[12]，以及分別與二體和單體狀態(tài)內(nèi)源性配體 CXCL8結(jié)合的CXCR2-Gi復合物[13]。其中前三種為非激活狀態(tài)或者類似激活狀態(tài)的趨化因子受體晶體結(jié)構(gòu)，后兩個受體的結(jié)構(gòu)均為結(jié)合內(nèi)源性配體的完全激活態(tài)趨化因子受體與下游G蛋白結(jié)合的復合物冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)。此外，研究者們還解析了一系列小分子拮抗劑結(jié)合的趨化因子受體結(jié)構(gòu)，包括CXCR4[14]、CCR5[15]、CCR9[16]、CCR2[17]、CCR7[18]和CXCR2[13]（圖1）等。

圖1 目前為止已解析的獨特的趨化因子受體結(jié)構(gòu)（藍灰色字體為PDB編號，亮藍色字體表示復合物所結(jié)合的配體，紅色字體表示結(jié)合趨化因子的受體結(jié)構(gòu)。每個結(jié)構(gòu)根據(jù)B因子進行著色，2LNL（核磁結(jié)構(gòu)）除外）

2.1 趨化因子類配體與受體的相互作用

通常，趨化因子與受體的結(jié)合過程在空間和時間上稱為“兩步結(jié)合模型”[19]，第一步主要是趨化因子受體的N端對趨化因子的招募識別并結(jié)合其球狀核心，第二步主要是趨化因子的N末端插入到受體的跨膜區(qū)域口袋處進而激活受體。兩步結(jié)合模型的位點一般稱為趨化因子識別位點（chemokine recognition site, CRS）1和2[20]。研究表明，趨化因子的N端信號傳導域在趨化因子受體激活中起著重要作用[19-21]。在趨化因子被招募初期，受體N端初始區(qū)域通過表面靜電吸附等作用力將趨化因子吸引招募過來，受體N端靠近跨膜區(qū)TM1的殘基與趨化因子的球狀核心（N loop和β折疊）形成靜電和疏水相互作用，將趨化因子穩(wěn)定在受體跨膜區(qū)附近。隨后，趨化因子的N末端逐漸靠近結(jié)合受體正構(gòu)口袋，與跨膜區(qū)螺旋和胞外loop區(qū)形成相互作用，引起受體構(gòu)象變化，從而激活下游信號。結(jié)合過程中，CRS1主要負責配體親和性與識別功能，CRS2則主要與受體激活和信號傳導功能相關聯(lián)。此外，還有提出介于CRS1和CRS2之間起承接關系的CRS1.5的位點，包括趨化因子N端中間保守半胱氨酸殘基與受體N端根部附近[9]。通常在CRS1.5處，趨化因子受體N端的Pro-Cys（PC）保守殘基中CysN-term與受體的第三個細胞外環(huán)上CysECL3形成二硫鍵，有助于CRS1相互作用的穩(wěn)定，起到彎折和定位作用[22]。近年來的趨化因子-趨化因子受體結(jié)構(gòu)解析，揭示了趨化因子與受體廣泛的結(jié)合界面，該結(jié)合界面在空間和時間上是連續(xù)不可孤立的。

趨化因子受體的正構(gòu)結(jié)合口袋可以分為主要和次要亞腔[23]，主要亞腔由靠近TM4(transmembrane helix 4)、TM5和TM6的口袋空腔組成，次要口袋指靠近TM1、TM2一側(cè)的空腔口袋，TM1和TM7則介于兩個亞腔之間（圖2）。通過結(jié)構(gòu)的對比分析發(fā)現(xiàn)，vMIP-II、CX3CL1或5P7-CCL5的N端主要在較深的次要口袋或同時在主、次要口袋亞腔中形成廣泛的相互作用。在CXCR2-CXCL8-Gi復合物的結(jié)構(gòu)中，CXCL8在CRS2中的結(jié)合位點和特異性相互作用，與已解析的CXCR4-vMIP-II、US28-CX3CL1或CCR5-5P7-CCL5晶體結(jié)構(gòu)存在較大差異。CXCL8的N末端在受體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合位點口袋較淺，只占據(jù)主要口袋亞腔一側(cè)，與ECL2形成氫鍵和疏水相互作用，并與TM5和TM6的靠近胞外區(qū)精氨酸殘基（R2786.62、R2085.35和R2125.39）形成鹽橋，在激活過程中起著關鍵作用（圖3（a））。同時，CXCL8中的30s loop區(qū)域上的“GP”殘基也與CXCR2的ECL2有較好的疏水相互作用，穩(wěn)定了ECL區(qū)域構(gòu)象。此外，CXCR2口袋中TM2和TM4上的極性殘基Lys2.64和Arg4.64的大側(cè)鏈可能會阻止CXCL8的N端更深地進入子口袋，使得CXCL8在淺層口袋結(jié)合，而Lys2.64和Arg4.64殘基只在CXCR2和CXCR1中存在，而在其他趨化因子受體中相應位置主要為保守的短側(cè)鏈的Ala2.64和Ser4.64。在CCR6-CCL20-Go結(jié)構(gòu)中，趨化因子CCL20的N末端較短（NH2-ASNFD），結(jié)合口袋與CXCL8類似甚至更加淺，十分靠近胞外區(qū)域，并同時占據(jù)主要和次要亞腔口袋。CCL20的N端主要與受體胞外的ECL區(qū)域和N末端形成氫鍵等相互作用，并和受體ECL2上的可能的激活關鍵殘基E19845.51形成鹽橋，與TM1上的R421.28、TM7上的K2987.35形成鹽鍵等相互作用。

此外，CXCL8的結(jié)合模式與CXCR4中的vMIP-II的總體架構(gòu)更為相似（圖2），表明該CXC趨化因子亞家族可能具有相似的結(jié)合模式。由于CXCR4-vMIP-II和CCR5-5P7-CCL5處于非激活的狀態(tài)，其跨膜區(qū)與CXCR2激活態(tài)差異較大，而CX3CL1結(jié)合的US28處于近似激活的狀態(tài)，因此受體結(jié)構(gòu)上與CXCR2激活態(tài)更為相似。內(nèi)源性配體CXCL8和CCL20結(jié)合的均是完全激活態(tài)的相應受體，它們與受體的作用均屬于淺口袋結(jié)合模式。

圖2 趨化因子-趨化因子受體復合物相互作用口袋橫截面示意圖（粉色表示CCR6，亮黃色表示CCL20，橙色表示CXCR2，紅色和藍色分別表示二體CXCL8中的兩個分子，淡紫色表示CXCR4，三文魚色表示vMIP-II，淺黃色表示US28，綠色表示hCXCL1，淺藍色表示CCR5，深紫色表示5P7-CCL5）

2.2 趨化因子受體與G蛋白的相互作用

趨化因子受體家族成員主要通過Gi/o蛋白傳遞信號，在CXCR2-CXCL8-Gi和CCR6-CCL20-Go復合物結(jié)構(gòu)中，受體主要與G蛋白α亞基相互作用介導信號傳遞。相互作用界面由受體的TM3、TM5、TM6、ICL2和ICL3以及Gα亞基的α5螺旋、αN螺旋和αN-β1環(huán)、β2-β3環(huán)組成，α5螺旋結(jié)合在受體7TM近胞內(nèi)區(qū)形成的口袋中。主要的相互作用與其他已解析的GPCR-Gi復合物結(jié)構(gòu)相似[24-30]。在CXCL8-CXCR2-Gi結(jié)構(gòu)中，Gαi的α5螺旋的兩個大疏水側(cè)鏈的氨基酸L353和L348指向CXCR2靠近胞內(nèi)區(qū)的疏水口袋。該疏水區(qū)域主要由TM3、TM5、TM6和TM7的近胞質(zhì)末端的疏水殘基組成。由于CXCR2的ICL3相對較短，其上的疏水殘基與Gαi的α5螺旋殘基具有較好的疏水相互作用， 并與α5螺旋的部分側(cè)鏈形成氫鍵。相比較而言，在GPCR-Gs的復合物結(jié)構(gòu)中ICL2保守的F/L34.51與Gαs形成疏水相互作用。但在大多數(shù)趨化因子受體中，相應位置側(cè)鏈較短的V/T34.51減弱了這種相互作用。ICL2的氨基酸殘基的差異可能有助于分析趨化因子受體對下游 G蛋白的選擇性。在CCR6-CCL20-Go結(jié)構(gòu)中，受體上的ICL2形成兩圈α螺旋結(jié)構(gòu)，其上的苯丙氨酸側(cè)鏈也與G蛋白loop區(qū)和α5的側(cè)鏈形成較好的疏水相互作用，通常的34.51保守位點仍然為趨化因子受體家族保守的小側(cè)鏈的氨基酸V34.51。此外，當將CXCR2-CXCL8-Gi復合物結(jié)構(gòu)與β2AR-Gs結(jié)構(gòu)[31]進行比較時，主要區(qū)別在于Gαi和Gαs的α5螺旋的相對位置，以及Gαs偶聯(lián)受體中TM6的相應位置的偏移。與TM5和TM6相互作用的Gαs的α5螺旋中的C末端殘基比Gi更大，因此胞質(zhì)結(jié)合腔中TM5、TM6的開合大小會發(fā)生相應改變來容納不同側(cè)鏈大小的α5螺旋?？傮w來說，研究者們已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上闡明了結(jié)合內(nèi)源性趨化因子的激活態(tài)受體和下游G蛋白之間的相互作用界面，以及G蛋白偶聯(lián)至趨化因子受體的分子基礎。

3 趨化因子受體激活機制分析

最近CXCR2-CXCL8-Gi和CCR6-CCL20-Go復合物結(jié)構(gòu)的解析為我們打開了探索趨化因子激活機制的大門。由于研究者同時也解析了CXCR2結(jié)合別構(gòu)拮抗劑的非激活態(tài)結(jié)構(gòu)，我們主要以CXCR2為例來闡明趨化因子受體家族的激活機制。

白細胞介素8 (CXCL8, Interleukin-8或IL-8)屬于CXC類趨化因子家族ELR+亞家族成員，其N末端具有ELR特征序列[32]。在高濃度狀態(tài)下CXCL8以同源二聚體形式存在，而低濃度下以單體形式存在。研究表明，單體和二聚體狀態(tài)的CXCL8都能夠識別并與CXCR2結(jié)合，激活下游信號并參與人體復雜的炎癥反應調(diào)控[33]。因此CXCL8/CXCR2是抗癌抗炎的重要藥物靶標。

在已解析的二聚體CXCL8結(jié)合的CXCR2-Gi復合物結(jié)構(gòu)中，將二聚體CXCL8中兩個蛋白分子定義為CXCL8-A和CXCL8-B。CXCL8-A分子與CXCR2受體正構(gòu)口袋結(jié)合并激活下游信號，與單體狀態(tài)的CXCL8結(jié)合機制幾乎相同，另一側(cè)的CXCL8-B與CXCR2只有較弱的相互作用。研究者通過比較CXCR2的激活態(tài)與非激活態(tài)發(fā)現(xiàn)，CXCL8中的N末端ELR基序在受體激活過程中起著十分關鍵的作用：當受體識別并結(jié)合CXCL8后，在趨化因子正構(gòu)結(jié)合口袋處，CXCL8的N末端氨基酸R6和L5與受體建立的氫鍵和疏水相互作用分別起錨定點作用，以穩(wěn)定CXCL8的N端。CXCR2的Y197ECL2與CXCL8的L5和E4的羰基氧形成氫鍵，以誘導受體ECL2的構(gòu)象變化并促進激活。在協(xié)同作用下，主要亞腔口袋中的E4與R2085.35、R2125.39和R2786.62分別形成關鍵的鹽鍵相互作用，引起TM5胞外部分向內(nèi)大幅度擺動，成為CXCR2受體激活的主要驅(qū)動力（圖3（a、 c））。

CXCL8引起TM5的構(gòu)象變化后，A類GPCR家族典型的激活特征之一——P5.50I3.40F6.44基序中，P2235.50發(fā)生旋轉(zhuǎn)，I1343.40和F2606.44發(fā)生協(xié)同重排（圖3（b）），并伴隨經(jīng)典開關殘基W2646.48的側(cè)鏈構(gòu)象變化（圖3（b））。隨后TM6螺旋靠近胞內(nèi)區(qū)的部分向外大幅擺動，TM7則向跨膜區(qū)中心靠近TM3和TM5的方向移動，通過氫鍵等形成螺旋之間的相互作用。此外，CXCR2的激活過程中，還表現(xiàn)出A類家族受體激活的其他特征，包括經(jīng)典的NPxxY（N3107.49、P3117.50和Y3147.53）和DRY（D1433.49、R1443.50和Y1453.51）保守結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化。

圖3 CXCR2-CXCL8-Gi為例展示的趨化因子受體家族激活機制：（a）CXCR2激活態(tài)結(jié)構(gòu)展示圖；（b）關鍵特征位點激活示意圖；（c）CXCR2受體激活模型圖

與其他已解析的與小分子或多肽結(jié)合的GPCR結(jié)構(gòu)不同，趨化因子受體的激活觸發(fā)位點相對較淺，靠近受體的胞外段。這主要是由于趨化因子刺激受體相應口袋關鍵氨基酸，引起受體TM5的構(gòu)象變化，進而導致關鍵的螺旋間相互作用被破壞，如TM3和TM6發(fā)生旋轉(zhuǎn)，并影響受體的近胞內(nèi)端跨膜區(qū)和loop區(qū)域的構(gòu)象，從而使得G蛋白α亞基能夠結(jié)合到胞內(nèi)區(qū)，引起下游信號傳遞（圖3（c））。

4 總結(jié)和展望

在過去的幾十年里，趨化因子及趨化因子受體因在人體細胞遷移和抵御病原體入侵中起到的重要作用而引起了人們的廣泛關注。除了它們在HIV病理機制方面的作用外，人們也更多地認識到它們在自身免疫及炎癥、癌癥方面的重要影響。趨化因子網(wǎng)絡可以說是免疫系統(tǒng)的主要管理調(diào)控者。由于趨化因子及其受體功能多樣，相互作用錯綜復雜，一直以來的結(jié)構(gòu)信息不完善，科學家們對趨化因子及其受體的功能機制研究和相關的藥物研發(fā)受到制約。近年來，隨著多個趨化因子受體結(jié)構(gòu)的不斷解析，尤其是通過冷凍電鏡技術解析的同時結(jié)合內(nèi)源性配體和下游信號分子G蛋白的趨化因子受體復合物三維結(jié)構(gòu)，展示了內(nèi)源性趨化因子獨特的淺口袋結(jié)合模式，以及受體與下游G蛋白的相互作用分子機制，使我們對內(nèi)源性蛋白分子的識別、趨化因子信號轉(zhuǎn)導和激活機制有了更深入全面的理解，也為探索趨化因子受體家族相關多肽、抗體類藥物設計研發(fā)提供了指導方向。然而，趨化因子與其受體具有廣泛復雜的細胞來源以及生物學效應，目前仍有大量未知的過程機制和待解決問題，需要科學家結(jié)合不同的研究方法，在分子、細胞、組織、器官和動物等不同尺度深入探索。