漢族健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性及單倍型的分布特征*

白 微，葉 瑾，奚經(jīng)巧，2，林 枝，蔡文品，2△

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.中醫(yī)藥科研實(shí)驗(yàn)中心，浙江溫州 325000)

人類白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)位于人類第6號染色體短臂上，是一群緊密連鎖基因群，屬于人類非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子。HLA-G包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)，HLA-G 3′UTR富含AU的基序，聚腺苷酸信號和微RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，不同于編碼區(qū)的低多態(tài)性，UTR呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性。HLA-G 3′UTR的基因多態(tài)性與HLA-G表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，該區(qū)域約有30個多態(tài)性位點(diǎn)[1]，研究最多的是14 bp插入/缺失，與HLA-G mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)[2]。其他的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)還有+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G等，被證實(shí)與mRNA降解和miRNA結(jié)合有關(guān)[2]。正常生理?xiàng)l件下，HLA-G分子僅在母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、胸腺、胰島及間充質(zhì)干細(xì)胞等少數(shù)免疫豁免組織表達(dá)[3]。HLA-G特異性高表達(dá)于絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，參與母胎界面免疫耐受的誘導(dǎo)和維持[4]，許多研究表明HLA-G基因多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇等病理妊娠有較大相關(guān)性[3]。HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性與妊娠相關(guān)的研究多集中在14 bp插入/缺失，其他位點(diǎn)的研究甚少，且有研究表明不同地區(qū)不同種族人群HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性存在異質(zhì)性[5]。因此，本研究分析了本地區(qū)HLA-G 3′UTR多個位點(diǎn)在健康妊娠婦女中的分布特點(diǎn)，為本地區(qū)健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性的分布提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為后續(xù)妊娠相關(guān)疾病的研究打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月至2018年10月本院產(chǎn)前檢查婦女168例，年齡18～41歲，平均(27.1±4.3)歲，均為漢族，無高血壓、糖尿病、腎臟疾病等基礎(chǔ)疾病，無糖尿病、高血壓等妊娠期并發(fā)癥。所有孕婦均簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：WTCM-H-2017035)。

1.2 方法

1.2.1樣品采集與處理

平靜狀態(tài)下選取合適的肘靜脈，用美國BD公司生產(chǎn)的采血管采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血2～3 mL，-80 ℃保存，用于血液全基因DNA提取。

1.2.2外周血液全基因DNA提取

采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的全基因組DNA提取試劑盒提取血液全基因DNA，所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用NanoDrop One核酸濃度分析儀測定提取的DNA濃度和純度。

1.2.3HLA-G 3′UTR基因PCR擴(kuò)增

利用Primer Premier5.0軟件進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列HLA-G-3′UTR正向：5′-GTG GGT TGT TGA GGG-3′；HLA-G-3′UTR反向:5′-GTC TTC CAT TTT TGT CTC T-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物500 bp。根據(jù)PCR試劑說明書調(diào)整擴(kuò)增條件，采用25 μL體系Taq MasterMix 13 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水(ddH2O)8 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃長延伸10 min，步驟變性-步驟延伸進(jìn)行35個循環(huán)。

1.2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

配制1.5%瓊脂糖(上海Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)凝膠，Goldview染色(北京索萊寶科技有限公司)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，120 V恒壓電泳15 min，凝膠成像儀拍照記錄。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，500 bp處出現(xiàn)亮帶表明擴(kuò)增成功，進(jìn)行下一步測序。

1.2.5Sanger測序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測序，測得的序列利用CodonCode Aligner軟件比對分析，確定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)，P>0.05表示處于H-W平衡；SHEsis在線軟件直接統(tǒng)計(jì)基因型和等位基因頻率，進(jìn)行連鎖不平衡分析和單倍型分析。

2 結(jié) 果

2.1 H-W平衡檢驗(yàn)

HLA-G 3′UTR 8個多態(tài)性位點(diǎn)H-W平衡檢驗(yàn)結(jié)果見表1，結(jié)果顯示，14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G 8個位點(diǎn)的分布均符合H-W平衡(P>0.05)，該人群處于H-W平衡狀態(tài)，樣本具有本區(qū)域群體代表性。

表1 HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)H-W平衡檢驗(yàn)

2.2 HLA-G 3′UTR基因型與等位基因頻率分布

8個多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布見表2，結(jié)果顯示，14 bp ins/del位點(diǎn)以del等位基因和del/del基因型為主，占比分別為81.0%和65.5%；+3003C/T位點(diǎn)T等位基因和TT基因型占大多數(shù)，占比分別為99.4%和98.8%，未發(fā)現(xiàn)CC基因型；+3010G/C位點(diǎn)以G等位基因和GC基因型為主，占比分別為56.8%和47.0%；+3027C/A位點(diǎn)以C等位基因和CC基因型為主，占比分別為82.7%和68.4%；相似地，+3035C/T位點(diǎn)以C等位基因和CC基因型為主，占比分別為82.1%和67.3%；+3142C/G位點(diǎn)以C等位基因和CG基因型為主，占比分別為59.2%和51.8%；+3187A/G位點(diǎn)以G等位基因和AG基因型為主，占比分別為56.0%和47.6%；+3196C/G位點(diǎn)以C等位基因和CC基因型為主，占比分別為99.7%和99.4%，未發(fā)現(xiàn)GG基因型。

表2 HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因和基因型分布(n=168)

2.3 HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡及單倍型分析

8個多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡分析應(yīng)用SHEsis軟件，用連鎖不平衡系數(shù)D′進(jìn)行檢驗(yàn)分析，D′>0.7認(rèn)為是強(qiáng)連鎖，結(jié)果見圖1(數(shù)值表示百分?jǐn)?shù)，越接近1.0表示兩個位點(diǎn)連鎖越緊密，顏色越深表示兩個位點(diǎn)連鎖越緊密)。結(jié)果顯示，除+3003C/T與14 bp ins/del、+3027C/A、+3035C/T外，其他D′值均大于0.7，認(rèn)為這8個位點(diǎn)緊密連鎖，可以構(gòu)建單倍型。

圖1 HLA-G 3′UTR 8個基因多態(tài)性位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析情況

SHEsis結(jié)果顯示，8個基因多態(tài)性位點(diǎn)可以構(gòu)建14個單倍型，對常見的頻率較高的7個單倍型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別是UTR-1(DTG CCC GC)、UTR-2(ITC CCG AG)、UTR-3(DTC CCG AC)、UTR-4(DCG CCC AC)、UTR-5(ITC CTG AC)、UTR-6(DTG CCC AC)、UTR-7(ITC ATG AC)，單倍型組成從左到右為14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G，見表3。UTR-1，UTR-3，UTR-7頻率大于0.03，三者共占94.3%(317/336)，分別占55.0%、23.8%、15.5%，其中UTR-1超過半數(shù)以上。

表3 HLA-G 3′UTR多態(tài)性位點(diǎn)單倍型分析

3 討 論

HLA-G基因位于人染色體6p23.1，全長6.0 kb，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，從部分6號外顯子開始延伸至多聚A尾巴前端，包括7號外顯子、8號外顯子的區(qū)域被稱為3′UTR[6]。HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性調(diào)控了HLA-G的表達(dá)水平，與多種臨床疾病有關(guān)，從對妊娠期HLA-G的研究開始，該領(lǐng)域就關(guān)注了HLA-G在惡性和炎癥性疾病中的表達(dá)及其可能的重要性，以及在心臟和肝/腎器官移植中的應(yīng)用。HLA-G選擇性高表達(dá)于絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)母胎界面免疫耐受狀態(tài)的維持[7]。HLA-G 3′UTR參與穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本，影響mRNA的翻譯水平和分子表達(dá)，改變疾病的遺傳易感性[8-10]。有研究報道，HLA-G與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇等病理妊娠有較大相關(guān)性[11-12]，但多項(xiàng)研究結(jié)果具有一定爭議性，這可能是由于基因多態(tài)性與種族、地區(qū)、環(huán)境有關(guān)。因此，調(diào)查本地區(qū)的HLA-G 3′UTR位點(diǎn)基因多態(tài)性分布特點(diǎn)，分析基因多態(tài)性位點(diǎn)之間的連鎖不平衡和單倍型具有一定必要性。

本研究通過檢測分析溫州地區(qū)漢族健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR 8個基因多態(tài)性位點(diǎn)：14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G，發(fā)現(xiàn)8個基因多態(tài)性位點(diǎn)具有各自的分布特征，以純合子基因型為主的位點(diǎn)如14 bp ins/del、+3027C/A、+3035C/T，以雜合子基因型為主的位點(diǎn)如+3010G/C、+3142C/G、+3187A/G；而+3003C/T、+3196C/G未檢測到CC和GG基因型。SNPs在人類基因組中廣泛存在，占所有已知基因多態(tài)性的90%以上，具有穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)。某些SNPs雖然與疾病無關(guān)，但是因?yàn)榕c致病基因相鄰或者多個SNPs的聯(lián)合效應(yīng)對疾病產(chǎn)生重要影響。近年來，越來越多的研究關(guān)注了聯(lián)合檢測SNPs構(gòu)建單倍型對疾病的影響。本研究連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，8個基因多態(tài)性位點(diǎn)緊密連鎖，在對常見的8個單倍型統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)溫州地區(qū)妊娠婦女單倍型的分布特征，UTR-1、UTR-3、UTR-7單倍型頻率大于0.03，三者共占94.3%，其中UTR-1超過半數(shù)以上，是溫州地區(qū)妊娠婦女主要的單倍型。

LUCENA-SILVA等[13]研究了巴西南部和北部健康人群HLA-G 3′UTR分布，發(fā)現(xiàn)在+3003CT、TT基因型的分布有明顯差異，說明同種族不同區(qū)域基因多態(tài)性位點(diǎn)的分布存在差異；與本研究相比，在多個位點(diǎn)具有差異，巴西人群14 bp位點(diǎn)以雜合子del/ins為主，本研究結(jié)果以純合子del/del為主；巴西人群以+3142G等位基因?yàn)橹?，而本研究?3142C等位基因?yàn)橹鳎话臀魅巳阂?3187A等位基因、AA純合子基因型為主，而本研究以+3187G等位基因、AG雜合子基因型為主。新西蘭健康育齡婦女HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)的分布[14]與本研究相似，但在新西蘭健康育齡婦女中未發(fā)現(xiàn)+3027AA基因型。研究報道，14 bp ins/del位點(diǎn)基因多態(tài)性影響HLA-G mRNA的穩(wěn)定性，可能與miRNA結(jié)合位點(diǎn)的破壞有關(guān)[2]。+3027C/A、+3142C/G、+3187A/G等SNP位點(diǎn)也都是miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，或與AU富集區(qū)有關(guān)，位點(diǎn)的多態(tài)性影響miRNA的穩(wěn)定性和降解速度，以此在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)HLA-G的表達(dá)[9]。單倍型分布特點(diǎn)上，巴西人群UTR-1、UTR-2、UTR-3占多數(shù)[13]，分別為29.5%、22.8%、15.8%，與本研究結(jié)果不同；新西蘭健康育齡婦女的單倍型以UTR-1、UTR-2、UTR-4為主[14]，分別為33.3%、26.0%、19.8%，雖然等位基因和基因型與本研究結(jié)果相似，但是單倍型卻不同。已有報道顯示，HLA-G 3′UTR單倍型與先兆子癇[15]、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[16]、敗血癥[17]等有一定關(guān)聯(lián)性。HLA-G 3′UTR單倍型與HLA-G的表達(dá)有關(guān)，UTR-1與高水平表達(dá)相關(guān)，UTR-5、UTR-7與低水平表達(dá)相關(guān)[18]，UTR-2/3/4/6與中等水平表達(dá)相關(guān)。各種族各地區(qū)不同人群在基因多態(tài)性及單倍型的分布差異可能是疾病分布不同的原因，育齡婦女與其他人群具有不同的HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性和單倍型分布，不同地區(qū)育齡婦女的分布也不盡相同。以健康妊娠婦女為代表調(diào)查本地區(qū)健康育齡婦女的HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性分布，可以更好地為妊娠期并發(fā)癥的研究打下基礎(chǔ)，深入了解HLA-G 3′UTR在妊娠中的作用。

綜上所述，本研究中溫州地區(qū)漢族健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因、單倍型的分布特征明顯，等位基因以14 bp del、+3003T、+3010G、+3027C、+3035C、+3142C、+3187G、+3196C為主，基因型以14 bp del/del、+3003TT、+3010GC、+3027CC、+3035CC、+3142CG、+3187AG、+3196CC為主，單倍型以UTR-1(DTG CCC GC)、UTR-3(DTC CCG AC)、UTR-7(ITC ATG AC)為主，UTR-1是最主要的單倍型。后續(xù)將進(jìn)一步深入研究HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性及單倍型在妊娠并發(fā)癥如先兆子癇、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等的意義，以及與mRNA和miRNA相關(guān)的分子機(jī)制。