骨內(nèi)壓干預對DH豚鼠退變脛股關(guān)節(jié)軟骨保護作用及軟骨內(nèi)2型膠原與MMP13表達的影響*

王 碩，馬劍雄，杜育任，黃洪超，焦尚起，史建國，馬信龍△

(1.中國人民解放軍天津康復療養(yǎng)中心/原解放軍464醫(yī)院骨科，天津 300381；2.天津醫(yī)院骨科研究所 300050)

退行性膝骨關(guān)節(jié)炎是常見關(guān)節(jié)退變性疾病，約80%的65歲以上人群患有退行性膝骨關(guān)節(jié)炎，因關(guān)節(jié)軟骨退變，最終可導致關(guān)節(jié)功能喪失[1-2]。退行性膝骨關(guān)節(jié)炎的主要危險因素是年齡，隨著人口的老齡化，其發(fā)病率迅速升高，帶來嚴重的社會經(jīng)濟問題。生理情況下，軟骨細胞及軟骨基質(zhì)維持著關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)；在退行性膝骨關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白聚糖被切割，2型膠原也被降解[3-4]。膠原蛋白是一種三螺旋蛋白，對大多數(shù)蛋白酶具有抗性，但可被基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)有效識別和降解。MMP13在一個獨特的位點催化2型膠原的水解，從而產(chǎn)生3/4和1/4長度的多肽產(chǎn)物[5-6]。MMP13屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族，是參與細胞外基質(zhì)(ECM)重塑的鋅依賴性內(nèi)肽酶。骨內(nèi)高壓被認為與退行性膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛相關(guān)，主要指骨內(nèi)血流動力學異常[7]。研究發(fā)現(xiàn)，髕骨軟骨軟化存在膝前痛的患者，其髕骨內(nèi)壓升高。通過穿刺減壓或截骨可迅速降低骨內(nèi)壓，緩解疼痛[8]。本研究擬探討骨內(nèi)壓干預對Dunkin Hartley(DH)豚鼠退變脛股關(guān)節(jié)軟骨的保護作用，以及對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)2型膠原、MMP13表達的影響，為退變性關(guān)節(jié)炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物喂養(yǎng)及分組

雄性DH豚鼠6、9、12、18月齡各10只(n=40)，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SYXK(渝)2019-0011，豚鼠生產(chǎn)許可證號：SYXK(渝)2016-0018。其中，非減壓組各月齡5只，減壓組各月齡5只。動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度(55±3)%，12 h光照-黑暗循環(huán)(光照時間6：00-18：00)。

1.1.2實驗儀器與試劑

PT-30陶瓷厚膜壓力傳感器(美國DJ公司)，TRIzol?試劑(美國ThermoFisher Scientific公司)，mi Script Ⅱ RT試劑盒(德國Qiagen GmbH公司)，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國Clontech Laboratories公司)，ABI 7500型RT-qPCR儀(美國ThermoFisher Scientific公司)，2型膠原、MMP13兔多克隆一抗(美國Sigma公司)，MaxVision TM HRP-聚合物抗鼠/兔IHC試劑盒(美國MaxVision公司)，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1各組DH豚鼠膝關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓測定

非減壓組適應性飼養(yǎng)結(jié)束后測定骨內(nèi)壓，減壓組減壓術(shù)后測定骨內(nèi)壓。操作方法：膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱形切口，近端起自股骨內(nèi)髁，遠端至脛骨內(nèi)髁，逐層切開皮膚、皮下組織，保護膝內(nèi)側(cè)血管及神經(jīng)，顯露膝內(nèi)側(cè)副韌帶，選擇膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶股骨遠端、脛骨近端附著點為測壓穿刺點，逐級穿刺針由內(nèi)側(cè)向外側(cè)穿刺至抵住對側(cè)骨皮質(zhì)，測壓孔直徑為?0.7 mm[9]，連接PT-30陶瓷厚膜壓力傳感器，股骨遠端、脛骨近端測壓完畢后，拔除穿刺針，逐層嚴密縫合傷口。

1.2.2減壓術(shù)實施

選擇膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶股骨遠端、脛骨近端附著點為穿刺減壓點，使用直徑?1.5 mm、?2.0 mm麻花鉆頭，由內(nèi)側(cè)向外側(cè)穿刺擴孔減壓，至抵住對側(cè)骨皮質(zhì)，減壓孔直徑為?2.0 mm，減壓后分別于術(shù)后4周測壓。

1.2.3脛股關(guān)節(jié)軟骨2型膠原、MMP13 mRNA表達的測定

實驗期間無DH豚鼠死亡，實驗結(jié)束后(實驗周期為4周)，立刻處死DH豚鼠，獲取脛股關(guān)節(jié)軟骨；應用TRIzol?分離總RNA，mi Script Ⅱ RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒檢測mRNA表達水平。反應系統(tǒng)以20 μL的體積進行，熱循環(huán)條件如下：95 ℃持續(xù)10 min，然后40個循環(huán)(95 ℃持續(xù)10 s，60 ℃持續(xù)2 min，72 ℃持續(xù)2 min，在72 ℃下延長10 min)。通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析目標基因和對照。2型膠原引物正向：5′-ATG ACA GCG GCA CCT ACC T-3′，反向：5′-CCT ATT GTC CCT CGT GCG-3′；MMP13引物正向：5′-ACA CTC CAG CTG GGA TAT AAT ACA ACC TGC TA-3′，反向：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG CAC TTA GC-3′；GAPDH引物正向：5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGA GA-3′，反向：5′-ATG GCA TGG ACT GTG GTC AT-3′；U6引物正向：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，反向：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。使用Livak法分析數(shù)據(jù)，將目的mRNA表達水平相對于GAPDH/U6標準化。所有數(shù)據(jù)表示為3個獨立實驗的均值。

1.2.4脛股關(guān)節(jié)軟骨2型膠原、MMP13表達的測定

將脫鈣后石蠟包埋的5 μm脛股關(guān)節(jié)組織切片置于75 ℃烤箱中6 h，逐級脫蠟至水，3%過氧化氫(H2O2)去離子水室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，之后于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)行抗原熱修復。將組織切片分別與抗2型膠原、MMP13的一抗以1∶400的稀釋度孵育過夜，之后用MaxVision TM HRP-聚合物抗鼠/兔IHC試劑盒和DAB處理，用0.5%蘇木素行輕度核復染。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓比較

6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓均明顯低于非減壓組(P<0.05)；且隨月齡增長，兩組骨內(nèi)壓均先增加后降低，至12月齡時骨內(nèi)壓達到峰值，兩組組內(nèi)不同月齡組脛股關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓存在明顯差異(股骨側(cè)：F=12.548、9.875，P<0.001；脛骨側(cè)：F=11.687、9.667，P<0.001)，見表1。

表1 兩組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓比較

2.2 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)形態(tài)學改變

隨時間推移，6、9、12、18月齡豚鼠脛股關(guān)節(jié)均表現(xiàn)出軟骨退變(脛骨近端內(nèi)外側(cè)緣可見明顯流水樣軟骨樣或骨樣增生、明顯軟骨缺損等)，但與非減壓組相比，減壓組退變程度更輕。骨內(nèi)減壓對于退變程度不同的關(guān)節(jié)軟骨均展現(xiàn)了明顯的保護作用，見圖1。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)。

2.3 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)2型膠原mRNA水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)2型膠原mRNA水平均明顯高于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組2型膠原mRNA水平逐漸降低，至18月齡時，2型膠原mRNA水平達到最低值，兩組組內(nèi)不同月齡DH豚鼠2型膠原mRNA水平存在明顯差異(股骨側(cè)：F=10.657、8.997，P<0.001；脛骨側(cè)：F=8.635、6.694，P<0.001)，見表2。

表2 兩組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)2型膠原mRNA水平比較

2.4 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)MMP13 mRNA水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)MMP13 mRNA水平均明顯低于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組MMP13 mRNA水平逐漸升高，至18月齡時MMP13 mRNA水平達到峰值，兩組組內(nèi)不同月齡DH豚鼠MMP13 mRNA水平存在明顯差異(股骨側(cè)：F=9.658、12.698，P<0.001；脛骨側(cè)：F=13.547、10.258，P<0.001)，見表3。

表3 兩組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)MMP13 mRNA水平比較

2.5 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)2型膠原表達水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)2型膠原表達水平均明顯高于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組2型膠原表達水平逐漸降低，至18月齡時，2型膠原表達水平達到最低值，兩組組內(nèi)不同月齡DH豚鼠2型膠原表達水平存在明顯差異(股骨側(cè)：F=6.998、12.547，P<0.001；脛骨側(cè)：F=8.992、10.548，P<0.001)，見表4、圖2～3。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)股骨側(cè)；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)股骨側(cè)。

表4 兩組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)2型膠原表達水平比較

2.6 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)MMP13表達水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)MMP13表達水平均明顯低于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組MMP13表達水平逐漸升高，至18月齡時，MMP13表達水平達到峰值，兩組組內(nèi)不同月齡DH豚鼠MMP13表達水平存在明顯差異(股骨側(cè)：F=6.878、10.369，P<0.001；脛骨側(cè)：F=10.636、9.635，P<0.001)，見表5、圖4～5。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)脛骨側(cè)；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)脛骨側(cè)。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)股骨側(cè)；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)股骨側(cè)。

表5 兩組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)MMP13表達水平比較

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)脛骨側(cè)；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)脛骨側(cè)。

3 討 論

退行性膝骨關(guān)節(jié)炎的主要特征是軟骨損傷、軟骨下骨重塑、關(guān)節(jié)間隙變窄、滑膜炎及關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成。無論最初的觸發(fā)因素如何，關(guān)節(jié)軟骨損傷都是退行性膝骨關(guān)節(jié)炎的主要病理改變。目前的臨床治療主要包括非甾體類抗炎藥(NSAIDs)、關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸結(jié)合物，以及最終的關(guān)節(jié)置換術(shù)等。關(guān)節(jié)軟骨營養(yǎng)補充劑如葡萄糖胺和硫酸軟骨素的功效尚存爭議，且目前尚無可延遲或逆轉(zhuǎn)與疾病相關(guān)的軟骨逐漸破壞的治療方法。由于這些方法不能保護關(guān)節(jié)軟骨或延緩疾病的發(fā)展，從而使該病發(fā)展為不可逆的ECM喪失和慢性殘疾，因此，開發(fā)新型治療手段對保護退行性膝骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)軟骨具有重要意義[10]。

骨內(nèi)減壓的理論基礎(chǔ)為病變局部的骨內(nèi)壓增高及血液循環(huán)瘀滯，因其可有效緩解退行性膝骨關(guān)節(jié)炎的靜息痛，臨床上已應用于股骨頭壞死、頑固性跟痛癥、凍結(jié)肩等疾病的除痛治療[11]。DH豚鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病變最早可見于3月齡，表現(xiàn)為內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨細胞局灶性死亡；6月齡表現(xiàn)為中層甚至深層軟骨細胞出現(xiàn)克隆性增殖；9月齡表現(xiàn)為脛骨骨贅、軟骨下骨硬化；12月齡表現(xiàn)為整個內(nèi)側(cè)間室軟骨退變。隨月齡增長，軟骨下骨板及松質(zhì)骨小梁的厚度及密度逐漸增加，彈性逐漸降低，其髓內(nèi)空間存在逐漸降低的趨勢。在灌注量和流出量不變的情況下，骨內(nèi)壓會逐漸升高，當空間減小超過其對灌注量的緩沖范圍時，升高的幅度會顯著增加；若軟骨下骨增生或塌陷，使髓腔容積進一步減少到某一程度時，骨內(nèi)血流灌注亦可發(fā)生障礙，致使骨內(nèi)壓降低。本研究結(jié)果顯示，減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓均明顯低于非減壓組；隨月齡增長，非減壓組、減壓組均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在12月齡時，骨內(nèi)壓達到峰值。結(jié)合DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)形態(tài)學改變的大體結(jié)果，6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)均表現(xiàn)了軟骨退變，如脛骨近端內(nèi)外側(cè)邊緣可見明顯流水樣軟骨樣或骨樣增生、明顯軟骨缺損等，但與非減壓組相比，減壓組退變程度更輕。骨內(nèi)減壓對于退變程度不同的脛股關(guān)節(jié)軟骨均展現(xiàn)了明顯的保護作用。這與上述討論一致，同時說明，骨內(nèi)減壓能夠通過明顯降低DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓，發(fā)揮對DH豚鼠退變脛股關(guān)節(jié)軟骨的保護作用。

MMPs是生長發(fā)育、傷口愈合和疾病病理生理過程中參與ECM重塑的酶。MMP13在生理pH值環(huán)境下調(diào)節(jié)原纖維膠原蛋白(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)和聚集蛋白聚糖7水平。MMP13對膠原蛋白的切割發(fā)生在內(nèi)部螺旋位點，產(chǎn)生1/4和3/4片段，并且在氨基端肽位點發(fā)生原纖維解聚[12]。MMP13未在健康成人組織中發(fā)現(xiàn)，但在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨中顯著表達。此外，有研究表明，優(yōu)先抑制MMP13的MMPs抑制劑可阻止骨關(guān)節(jié)炎中軟骨的降解[13]。人類膝退變關(guān)節(jié)軟骨細胞結(jié)合MMP13的能力增加，因此其損傷程度增加。膝退變關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細胞過表達MMP13，2型膠原是其底物[14]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，MMP13可能是治療退行性膝骨關(guān)節(jié)炎的靶點[15-17]。本次研究結(jié)果顯示，減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)2型膠原mRNA和蛋白表達水平均明顯高于非減壓組；隨月齡增長，非減壓組、減壓組呈現(xiàn)出降低趨勢，至18月齡時，2型膠原mRNA和蛋白表達水平達到最低值。減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關(guān)節(jié)MMP13 mRNA和蛋白表達水平均明顯低于非減壓組；隨月齡增長，非減壓組、減壓組呈現(xiàn)出上升趨勢，至18月齡時，MMP13 mRNA和蛋白表達水平達到峰值。以上說明，骨內(nèi)減壓能促進DH豚鼠退變脛股關(guān)節(jié)軟骨2型膠原mRNA和蛋白表達，抑制MMP13 mRNA和蛋白表達。

綜上所述，骨內(nèi)壓干預能夠明顯降低DH豚鼠退行性脛股關(guān)節(jié)骨內(nèi)壓，對退變關(guān)節(jié)軟骨具有明顯的保護作用；其機制與骨內(nèi)減壓后在促進DH豚鼠退變脛股關(guān)節(jié)軟骨2型膠原mRNA和蛋白表達的同時，抑制MMP13 mRNA和蛋白表達相關(guān)。