維生素D受體基因多態(tài)性與青少年代謝綜合征空腹血糖受損的關系研究

曹 涵，張 文

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院內分泌科，上海 201600)

青少年代謝綜合征(adolescent metabolic syndrome，MS)已成為全球發(fā)病率非常高的，以肥胖、高血糖、血脂代謝異常為特征的一組臨床癥候群[1]。MS與心血管疾病、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關。胰島素抵抗是MS發(fā)生的病理基礎。研究顯示，空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)與胰島素抵抗密切相關，尤其是當空腹血糖高于6.1mmol/L時胰島素抵抗更加嚴重[2]，而IFG增高則更有可能導致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]。

眾所周知，維生素D水平與兒童青少年生長發(fā)育密切相關。目前國外已有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D水平降低與青少年肥胖、血糖升高、血脂異常及胰島素抵抗密切相關[4-5]。但是目前國內對于維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)基因多態(tài)性與MS空腹血糖受損的關系研究報道較少。基于此，本研究擬探討維生素D受體基因多態(tài)性與MS患者維生素D水平及空腹血糖受損之間的關系，以期進一步分析和闡明維生素D在MS進展為糖尿病中的作用，為臨床采取更為有效的治療手段提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年3月至2019年8月在上海市松江區(qū)中心醫(yī)院接受治療的青少年代謝綜合征患者242例作為MS組。MS的診斷標準符合2012年中華醫(yī)學會兒科分會內分泌遺傳代謝學組、心血管學組及兒童保健學組共同推出的有關中國青少年MS定義的診斷標準[6]：年齡10～16歲，腰圍(waist circumference，WC)≥中國兒童青少年同年齡同性別的第90百分位數(shù)節(jié)點值，同時還應具備至少以下兩項：①空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)≥5.6mmol/L或已診斷為2型糖尿?。虎谑湛s壓(systolic blood pressure，SBP)≥130mmHg或舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)≥85mmHg；③高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)<1.03mmol/L；④空腹甘油三酯(triglycerides，TG)≥1.70mmol/L。納入標準：①近3個月體重穩(wěn)定；②除在學校進行體育活動以外，無規(guī)律性的運動習慣及活動；③家屬簽署知情同意書。排除標準：①有心血管事件者；②繼發(fā)性肥胖、繼發(fā)性高血壓、腎臟性疾病、血脂紊亂以及嚴重肝腎功能不全者；③正在服用影響血壓、肝功能、血糖、血脂以及維生素D水平的藥物。其中男孩136例，女孩106例；年齡11～16歲，平均年齡(12.56±2.47)歲。MS組患者根據(jù)是否出現(xiàn)空腹血糖受損分為IFG亞組(n=72)和Non-IFG亞組(n=170)，IFG亞組空腹血糖6.1～7.0mmol/L，符合空腹血糖受損的診斷標準[7]。另選取同期在我院體檢中心健康檢查的青少年(NC組)200例，其中男孩113例，女孩87例；年齡10～16歲，平均年齡(12.17±2.26)歲。兩組性別、年齡等一般資料具有可比性(均P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料及生化指標

收集各研究對象性別、年齡、身高、體重、腰圍，計算體質指數(shù)(body mass index，BMI)。禁食10～12h后于次日清晨7:00至8:00，抽取各受試對象肘靜脈血，檢測FPG、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)ins)、糖化血紅蛋白(Hemoglobin A1c，HbA1c)、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。采用全自動化分析儀檢測血脂指標：TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清中1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2D3]。

1.2.2 PCR-RFLP技術檢測VDR基因ApaⅠ位點多態(tài)性

將獲得的受試對象血樣標本250μL置于含有EDTA的EP管中，采用Axygen全血基因組DNA提取試劑盒提取樣本中DNA，并保存于-80℃冰箱中備用；采用PCR-RFLP技術檢測VDR基因ApaⅠ位點多態(tài)性。引物以及探針經(jīng)Primer Express 2.0軟件進行設計，并經(jīng)上海生工生物科技有限公司合成。上游引物序列：5′-CGCGTACGATCGCTGGCTAGC-3′，下游引物序列：5′-GGCGATCGACTAAGTACGCTACTAC-3′。PCR擴增體系為25L，其中含有5L PCR緩沖液，上游及下游引物各0.5L，5U/L Taq DNA聚合酶0.25L，2.5mmol/L的dNTPs 4.0L，剩余加入雙蒸水。SCN5A基因C5457T位點的擴增反應條件為：94℃預變性2min，而后按照94℃30s、59℃30s、62℃15s的順序進行40個循環(huán)，最后以62℃延伸1min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內切酶酶切反應2h，而后在ABI-7500 fast RT-PCR電泳儀上進行反應，抽取10%的樣本進行基因測序，從而確定基因分型檢測的準確性。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1各組對象臨床資料比較

研究結果顯示，MS組各亞組BMI、SBP、DBP、FPG、Fins、HbA1c、TG、HDL-C、HOMA-IR、1,25-(OH)2D3與NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(F/χ2值分別為9.574、6.632、6.417、7.836、12.369、8.254、7.884、7.994、11.334、12.417，均P<0.05)，詳見表1。

表1 MS亞組與NC組臨床資料比較

2.2 VDR基因ApaⅠ擴增結果

擴增條帶經(jīng)凝膠電泳分析顯示，純合子(AA型)為一條明亮的條帶(740bp)、雜合子(Aa)有三條帶(740bp、530bp和210bp)，純合子(aa)為兩條帶(530bp、210bp)，見圖1。

圖1 VDR基因ApaⅠ酶切電泳結果

2.3各組對象VDR基因ApaⅠ基因型及等位基因分布頻率

研究結果顯示，VDR基因ApaⅠ位點三種基因型及A、a等位基因頻率在NC組、Non-IFG亞組及IFG亞組中符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。三組研究對象VDR基因ApaⅠ基因型及等位基因分布頻率比較差異具有統(tǒng)計學意義，且aa基因型頻率、a等位基因頻率均在IFG亞組中最高，在NC組中最低(χ2值分別為36.954、31.501，均P<0.01)，見表2。

表2 兩組患者VDR基因ApaⅠ基因頻率與等位基因頻率分布[n(%)]

2.4 IFG亞組不同基因型患者臨床生化指標比較

研究顯示，不同基因型患者FPG、HbA1c、Fins、HDL-C、1,25-(OH)2D3比較差異有統(tǒng)計學意義，且aa基因型患者的FPG、HbA1c、Fins水平更高，HDL-C、1,25-(OH)2D3水平更低(F值分別為6.278、5.536、9.663、6.012、11.547，均P<0.05)，見表3。

表3 VDR基因ApaⅠ不同基因型臨床生化指標比較

2.5青少年代謝綜合征空腹血糖受損的危險因素分析

以MS患者中是否出現(xiàn)空腹血糖受損作為因變量(是為1，否為0)，以Non-IFG亞組及IFG亞組比較差異有統(tǒng)計學意義的因素作為自變量行Logistic回歸分析，結果顯示，BMI、FPG、HbA1c、HOMA-IR、aa基因型及a等位基因為MS患者空腹血糖受損的危險因素，HDL-C及1,25-(OH)2D3為MS患者空腹血糖受損的保護因素，其OR值及95%CI分別為2.416(1.397～6.222)、2.978(1.694～8.996)、1.896(1.207～7.554)、2.021(1.832～7.449)、2.142(1.214～8.094)、2.423(1.353～7.939)、0.421(0.384～0.852)、0.527(0.436～0.847)，均P<0.05，見表4。

表4 青少年代謝綜合征血糖受損的危險因素分析

3討論

3.1維生素D水平與兒童代謝綜合征的關系

維生素D水平與兒童青少年機體鈣磷代謝及肥胖發(fā)生密切相關。研究顯示，兒童青少年血維生素D水平降低與血糖升高、胰島素抵抗存在相關性，且易導致血壓、血脂異常[8]。維生素D在血液循環(huán)中主要以25-羥基維生素D的形式存在，在腎臟轉化為具有生物活性的1,25-二羥基維生素D。需要指出的是，目前對于維生素D如何影響糖代謝的作用機制尚不明確。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可以通過肌肉、肝臟以及胰島細胞上的維生素D受體調節(jié)細胞內鈣離子濃度以及對炎癥因子的釋放產(chǎn)生作用從而直接或者間接影響胰島素敏感性以及胰島β細胞功能[9]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，MS患者IFG亞組血清中1,25-(OH)2D3水平、HOMA-IR，與對照組、無IFG亞組比較差異有統(tǒng)計學意義，提示MS空腹血糖受損患者存在明顯的維生素D水平降低和胰島素抵抗，也進一步闡明了維生素D對于維持胰島β細胞功能的影響及對血糖的調節(jié)作用。

3.2維生素D水平與其受體基因多態(tài)性的關系

維生素D水平受到環(huán)境、地理位置、季節(jié)飲食及遺傳等因素的影響，其中遺傳因素是重要的影響環(huán)節(jié)之一[10]。維生素D受體基因多態(tài)性與兒童青少年維生素D水平已經(jīng)成為研究的熱點，而維生素D受體基因位點研究熱點主要集中在FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ等基因位點上[11-12]。但需要指出的是，不同的研究得出的結論不盡相同。國外一項研究顯示，維生素D受體基因FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ位點與維生素D水平無關[13]，但另有研究卻顯示維生素D受體基因FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ與維生素D缺乏呈顯著相關[14]。不同的研究結果可能與不同的種族、地理環(huán)境等因素有關。盡管國外研究顯示，不同維生素D基因位點與兒童青少年肥胖、血脂及血壓升高乃至胰島素抵抗均在一定程度上存在相關性[15-16]，但需要指出的是目前國內對于探討維生素D受體基因多態(tài)性青少年代謝綜合征患者的關系，尤其是空腹血糖受損之間的關系研究尚少。通過本研究發(fā)現(xiàn)，MS組患者各亞組與NC組比較存在維生素D受體基因ApaⅠ基因位點表達差異，經(jīng)多因素Logistic回歸分析顯示，aa基因型及a等位基因為MS患者空腹血糖受損的危險因素，說明青少年代謝綜合征患者維生素D受體基因多態(tài)性與空腹血糖受損存在相關性，臨床需要密切關注維生素D受體基因多態(tài)性與青少年代謝綜合征疾病之間的關系。

3.3維生素D及其受體基因多態(tài)性與遠期心血管事件的關系

維生素D水平與MS患者及遠期心血管事件有著一定關系，影響維生素D水平的因素很多，如飲食習慣、地理環(huán)境、遺傳等[17]。目前，國內對于這一關系的研究尚缺乏足夠的證據(jù)。通過本研究發(fā)現(xiàn)，aa基因型患者維生素D水平明顯低于AA基因型、Aa基因型，多因素Logistic回歸分析顯示維生素D水平是影響MS患者空腹血糖受損的影響因素。因此，筆者認為，一是aa基因型患者可能通過降低維生素D水平導致MS患者空腹血糖受損，因此建議臨床治療MS時需調整治療方案，適當加入維生素D制劑；二是需要進一步深入研究維生素D受體基因影響空腹血糖受損的機制，以進一步闡明維生素D在MS及糖尿病中的發(fā)生機制。

綜上，維生素D受體基因ApaⅠ位點多態(tài)性與MS患者空腹血糖受損存在一定相關性，其可能通過降低維生素D受體水平引起MS空腹血糖受損。